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糖基化修饰定量蛋白质组学

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蛋白质糖基化(Glycosylation)是一种常见的蛋白翻译后修饰,糖基化在生物体内起着重要的作用:对细胞具有保护、稳定、组织及屏障等多方面作用;可作为外源性受体的特异性配体,某些糖链可作为各种病毒、细菌及寄生物的特异受体;糖链也可作为内源性受体的特异性配体,参与介导清除、周转及胞内穿行作用; 糖链在受精过程中起着重要的作用。  
 
蛋白质糖基化是在糖基化转移酶作用下将糖链与蛋白质连接,和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。哺乳动物中蛋白质的糖基化类型可分为三种:N-糖基化、0-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。N-糖基化(N-linked glycosylation)是糖链通过与蛋白质的天冬酰胺的自由NH2基共价连接形成的,O-糖基化(O-linked glycosylation)是糖链与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的自由OH基共价连接, O-糖基化位点没有保守序列,糖链也没有固定的核心结构,组成既可是一个单糖,也可以是巨大的磺酸化多糖,因此与N-糖基化相比,O-糖基化分析会更加复杂。
 
在糖蛋白组研究中,由于糖修饰蛋白只占全蛋白组中的一部分,因此,针对糖蛋白组的研究,通常需要进行糖肽富集。目前常用的糖蛋白分离富集技术有以下五种:凝集素亲和技术、肼化学富集法、硼酸法、免疫法, 亲水相互作用色谱法(HILIC)
 
技术优势:
 
高级搜库:N-糖搜库软件GPSeeker :在提供常规的肽段、糖基化位点,组成信息的同时,可提供具体的糖型结构;
 
高通量搜库:O-糖搜库软件O-bracket:一次性可添加数十种修饰类型,直接证据(基于结构决定性碎片离子的鉴定和定量)实现精准的位点解析和组成,通量更高,搜索效率更高;
 
超长检测:70厘米长的分析柱(360μm外径× 75μm内径),总时长达4h;有效提高样本的分离效果;
 
准确检测:每例样本3次技术重复上机,有效增加糖链鉴定覆盖度以及准确度;
 
高分辨质谱:Orbitrap Exploris™ 480,在m/z 200下分辨率可达480,000
 
N-糖肽解析图例:
 
蛋白质组学
 
技术流程:
 
蛋白质组学
蛋白质组学
 
备注:O-糖研究需要在蛋白酶解前去除N-糖链,其他步骤一样
 
生信分析展示:
 
蛋白质组学
 
技术参数:
 
样本要求:
细胞        >5×107 cells/sample
动物组织   >1g/sample
植物组织   >200mg/sample
血液样本   >1 mL(注意用EDTA防凝)
血清        >0.5ml/sample
尿液        >2ml
酵母/微生物 >200mg/sample
完整蛋白    >100ug
 
储存和运输:
液氮或-80℃保存;足量干冰运输,避免反复冻融。
 
检测平台:
 
蛋白质组学
 
应用方向:
 
蛋白质组学
 
案例分享:
GPSeeker Enables Quantitative Structural N‑Glycoproteomics for Site- and Structure-Specific Characterization of Differentially Expressed N‑Glycosylation in Hepatocellular Carcinoma
应用GPSeeker糖肽分析软件研究肝细胞癌中差异表达的N-糖基化位点并表征结构特异性
研究内容:人肝癌细胞糖基化修饰定量蛋白组学
发表期刊:Journal of Proteomics
研究背景:
异常的N-糖基化修饰在癌症的发生发展过程中起着重要作用,目前美国食品和药物管理局(FDA)批准的大多数癌症生物标志物是糖蛋白。由于糖基化的微观异质性和宏观异质性,每种糖蛋白都含有多种糖形式,通常一种或几种位点和形态特异性糖结构是比糖蛋白本身更好的标记。在过去几年中,位点特异性糖形态的表征获得了快速发展并已经成功地进行了各种疾病中不同糖基化的大规模位点特异性表征。作者介绍了自主开发的一个完整的N-糖肽搜索引擎GPSeeker,与目前建立的糖形态分离和定量糖蛋白质组学工作流程结合,能够同时对差异表达的完整N-糖肽进行结构和定量表征。其核心算法为 (iMEF)搜索算法,基于此,作者利用GPSeeker和多肽的同位素二甲基标记技术,研究HCC肝癌细胞(相对于正常肝LO2细胞)中的DEGPs,成功的对糖肽的结构进行了定性表征并利用精确的相对丰度比进行了定量表征。
 
蛋白质组学
 
部分应用文献:
[1] Ohtsubo, K.; Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell 2006, 126 (5), 855−867.
[2] Pinho, S. S.; Reis, C. A. Glycosylation in cancer: mechanisms and clinical implications. Nat. Rev. Cancer 2015, 15 (9), 540−555.
[3] Oliveira-Ferrer, L.; Legler, K.; Milde-Langosch, K. Role of protein glycosylation in cancer metastasis. Semin. Cancer Biol. 2017,44, 141−152.
[4] Xue, Y.; Xie, J.; Fang, P.; Yao, J.; Yan, G.; Shen, H.; Yang, P.Study on behaviors and performances of universal N-glycopeptide enrichment methods. Analyst 2018, 143 (8), 1870−1880.
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