非靶标代谢流分析

经典代谢组学可以反映机体代谢物的变化及可能被激活的通路，但同一代谢物可能参与多条代谢通路而其丰度不发生变化， 代谢网络是复杂并且动态变化的，而代谢组学仅能提供静态的代谢物丰度信息，因此仍存在局限性，代谢流分析技术则可以 很好地弥补这一局限。为了深入了解细胞代谢过程，我们采用各种组学工具包括基因组学、宏基因组学、转录组学、蛋白质 组学和代谢组学进行分析。但由于这些组学技术目前无法充分反映转录后调控、酶活性及细胞过程。于是提出了代谢流组学（Fluxomics）来全面研究所有代谢物的流率（flux rates）,这样就可以很好的描述细胞在生理过程中的代谢活性。

Systems-level analysis of isotopic labeling in untargeted metabolomic data by X₁₃ CMS. Nature protocol, 2019

技术路线

 

技术参数

 

样本要求

细胞            1×10⁷ cells/sample

血清、血浆      200 μL/sample

尿液            1 mL/sample

组织            200 mg/sample

粪便/肠道内容物 200 mg/sample

微生物          1×10⁷ cells/sample

培养液          200 μL/sample

因组织特异性，某些组织可能检测不到稳定同位素标记的信号。

 

生物学重复

6-10个生物学重复

 

检测平台

UHPLC-Thermo Fisher QE HFX 或UHPLC-Thermo Fisher QE focus

 

技术优势

 

1、同位素追踪动态变化的代谢物丰度信息

由于代谢网络是复杂并且动态变化的，而代谢组学仅能提供静态的代谢物丰度信息，因此仍存在局限性（图A显示的是代谢 物的总量）。代谢流分析技术则可以很好地弥补这一局限。非靶代谢流分析技术利用稳定同位素标记特定的化合物，可以 识别代谢物同位素异数体的丰度比例（图B显示的区分不同代谢途径对同一的代谢物的相对贡献）。

 

Isotope Tracing Un targeted Metabolomics Reveals Macrophage Polarization-State-Specific Metabolic Coordination across Intracellular Compartments. iScience, 2018

 

2、同位素标记的代谢物丰度信息映射到KEGG通路中

将推荐注释代谢物映射到KEGG通路图中（图C）,不同颜色代表代谢物对应的峰的含量信息或峰的同位素体分布比例信息,可以发现同一代谢物参与多条代谢通路的活跃程度。无偏向性的检测同位素体在生物体内的全部传递情况。

 

 

3、同一标记底物映射的多条代谢通路关联整合

同一代谢终产物可能来源于多条代谢通路（图D）,不同颜色的碳原子表示不同代谢途径来源的碳源，通过整合多条代谢网络 之间的相互作用，推算出该化合物在细胞内代谢通路中的周转速率、方向和分布规律，区分多条代谢通路对细胞整体代谢的相 对贡献及其相互调控规律，系统监测生物体整体代谢通路的活跃程度，从而在动态水平上描述细胞的整体代谢活性。

 

Isotope Tracing Untargeted Metabolomics Reveals Macrophage Polarization-State-Specific MetabolicCoordination across Intracellular Compartments. iScience, 2018

 

4、深度挖掘未知代谢通路信息

将推荐注释代谢物映射到KEGG反应网络中（图E）,节点间的连线可以点击查看反应细节（图F）,深度挖掘代谢反应，根据个性化的课题设计，发现现有代谢途径未被发现的新的功能性信息。

 

 

应用方向

 

非靶标代谢流分析可以广泛应用于生命科学和医药研究中，包括细胞代谢调控、代谢新通路、疾病代谢机制、药物新靶 标发现与确证、药物药效及毒性评价、疾病诊断或预后生物标志物、药物代谢组学、精准用药等领域。

 

1、基因工程

提高基因工程菌目标代谢产物

基因改造前后的代谢功能变化

 

2、疾病机理

揭示肿瘤代谢抑制剂个性化治疗机制

疾病发生发展过程早期诊断的标志物

 

3、代谢重编程

炎症性巨噬细胞免疫代谢重编程机制

植物叶绿体代谢重编程机制

 

案例分析

本研究运用同位素标记技术，提出了一种新的非靶标同位素代谢分析方法（非靶标代谢流），运用非靶标代谢组检测同位素标记物质丰度变化，从而分析代谢途径流量的分布。同时也详细展示了非靶标同位素标记代谢流的分析流程。最后，以分析人类肺癌细胞在缺氧条件下的代谢物变化为例来阐述非靶标代谢流的分析方法：通过检测代谢流量变化，发现谷氨酰胺的增加促进乙酰辅酶a产生，经NAT8L催化合成的N-乙酰天冬氨酸产生于人肺腺癌A549细胞，而沉默NAT8L可以抑制A549，JHH-4、PH5CH8和BEAS-2B细胞的增值，同时也发现了NAA在癌细胞代谢中的潜在重要作用。非靶标代谢流解决了当前代谢组学研究的一个主要瓶颈，将代谢组的研究提升到更高的层次。

 

图1 非靶向代谢流分析流程图

 

图2 不同氧含量对肺癌细胞代谢流量的影响

 

图3 同位素质量分布相似性有助于化合物鉴定

 

参考文献

Daniel Weindl, Thekla Cordes, Nadia Battello, Sean C. Sapcariu, Xiangyi Dong, Andre Wegner and Karsten Hiller, Bridging the gap between non-targeted stable isotope labeling and metabolic flux analysis, Cancer & Metabolism, 2016,4:10.