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iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组研究

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iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组研究是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行标记,利用标记试剂中的二级报告离子来对蛋白进行精确鉴定和定量。
 
标记试剂分为两种:iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags),是分别由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术,采用多种同位素的标签,可与氨基(包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基)反应实现连接,通过高精度质谱分析,同时实现多个样本蛋白组的定性和定量。
 
标记试剂与原理:
 
蛋白质组学
备注:
Reporter: 报告离子基团,用来对不同肽段进行定量; 
Balance:平衡基团,保证同一肽段标记后母离子质量一致;
Peptide Reactive Group:肽反应基团,与氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基反应连接。
 
标记试剂盒种类:
 
蛋白质组学
 
iTRAQ/TMT技术研究流程:
 
蛋白质组学
 
生信分析展示:
 
蛋白质组学
 
技术优势:
 
适用范围广:可检测到的蛋白除了胞浆蛋白外,还有线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白。也能对任何类型的蛋白质进行鉴定,包括高分子量,酸性,碱性蛋白质;
 
高通量:一次可以实现多个样品的定性定量分析,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析;
 
结果可靠:基于高灵敏度和高分辨的串联质谱方法,定性与定量同步进行,同时得出定性和定量结果,重复样品间的蛋白表达量相关性高;
 
灵敏度高:分级分离,降低样品复杂度,相比凝胶电泳观测到的蛋白变化在2倍以上,iTRAQ计算出的蛋白变化在1.3-1.6倍之间,可检测低丰度蛋白;
 
分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白,小于10KDa或大于200KDa的蛋白、难溶性蛋白等;
 
自动化程度高:液质联用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。
 
技术参数:
样本要求:
动物及临床组织标本    100 mg/sample、
血清、血浆          200μL/sample
细胞 、微生物        1×107 cells/sample
植物嫩叶、嫩芽       500mg/sample
植物种子           200mg/sample
植物果肉           20g/sample
 
储存和运输:
 
液氮或-80℃保存;足量干冰运输,避免反复冻融。
 
检测平台:
 
蛋白质组学
 
应用方向:
 
蛋白组学
 
案例分享:
 
Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue
应用TMT技术研究由于年龄和高脂饮食引起的小鼠附睾脂肪组织蛋白质组的变化 
研究内容:小鼠附睾脂肪组织的TMT蛋白质组学
发表期刊:Molecular & Cellular Proteomics
影响因子:IF=6.54
研究背景:
肥胖症是一种世界性流行病,与代谢并发症如2型糖尿病、高血压、血脂异常和动脉粥样硬化的发病率增加有关。过去由于缺乏有效的高通量技术手段限制了对附睾组织的整个白色脂肪组织蛋白质组变化的研究。因而作者利用多组高通量TMT标记定量蛋白组技术对小鼠附睾组织的蛋白质组进行了深入的研究。
实验样本:
将20只8周龄的小鼠进行低脂或高脂饮食的喂养,时间为短(8周)或长(18周)(每个实验组5只小鼠)。收集附睾脂肪,溶解,取100mg进行胰蛋白酶消化。用TMT-10plex标记样品和pool样本,合并上机后分为9个馏分。 报告离子强度使用内部参考标度(IRS)进行标准化。差异表达的蛋白质通过edgeR的筛选来确定,并通过基因富集和网络分析进行表征。
实验策略:
采用了三组TMT-10-plex试剂盒进行标记。
分析软件:
Proteome Discoverer(1.4.1.14 version,Thermo Scientific), SEQUEST
分析策略:
Volcano plots ,Pearson correlation, Network analysis, Gene Enrichment
 
蛋白质组学
 
部分应用文献:
[1] Pengjun Jiang, Jun Wu, Xin Chen,et al.Quantitative proteomics analysis of differentially expressed proteins in ruptured and unruptured cerebral aneurysms by iTRAQ[J]. J Proteomics,2018,45-52.
[2] Fei Ge, Hongmei Hu, Xing Huang,et al. Metabolomic and Proteomic Analysis of Maize Embryonic Callus induced from immature embryo[J]. J Proteomics,2017,1004.
[3] Yong Xie, Yanpan Gao, Licheng Zhang,et al. Involvement of serum-derived exosomes of elderly patients with bone loss in failure of bone remodeling via alteration of exosomal bone-related proteins [J]. Aging Cell, Volume17, Issue3.
[4] Ying Liu, Yajing Fu, Qian Wang,et al. Proteomic profiling of HIV-1 infection of human CD4+ T cells identifies PSGL-1 as an HIV restriction factor [J]. Nature Microbiology 4,813–825.
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iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组研究