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定量磷酸化蛋白质组学

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蛋白质磷酸化修饰是生物体内最重要的共价修饰方式之一。研究表明,真核细胞中大约30%的蛋白经过磷酸化修饰。蛋白质磷酸化(Phosphorylation)是由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程,或者在信号作用下结合GTP,蛋白质磷酸化可以发生在多种氨基酸上,其中以丝氨酸 (S) 最多、苏氨酸 (T)次之、酪氨酸 (Y) 相对较少。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍,也是最重要的机制,在细胞信号转导、调控细胞增殖、发育、分化、凋亡过程中起重要作用。
 
磷酸化生物学功能:
变构调节,激活<- -> 失活;
有序<- -> 无序转变;
离子通道开<- -> 关;
蛋白-蛋白结合<- -> 解离;
特异性识别。
 
磷酸化肽段富集方法:
 
蛋白质组学
 
磷酸化修饰蛋白组技术研究流程:
 
蛋白质组学
 
技术参数:
样本要求:
动物及临床组织标本 200 mg/sample、
血清、血浆      500 μL/sample
细胞 、微生物    2×107 cells/sample
植物嫩叶、嫩芽   2g/sample
植物种子       500mg/sample
植物果肉       50g/sample
 
储存和运输:
液氮或-80℃保存;足量干冰运输,避免反复冻融。
 
检测仪器:
 
蛋白质组学
 
应用方向:
蛋白质组学
 
案例分享:
In vivo brain GPCR signaling elucidated by phosphoproteomics
磷酸化修饰定量蛋白质组学阐明体内脑G蛋白偶联受体信号
研究对象:小鼠海马、纹状体、皮层、小脑、延髓和嗅球的磷酸化修饰定量蛋白质组学
发表期刊:Science
影响因子:IF=41.845
研究内容:
G蛋白偶联受体(GPCR)超家族包括许多治疗领域的药物靶点,包括癌症和神经系统疾病。刺激单个GPCR,如κ阿片受体(KOR),通常激活平行通路,每个通路导致独特的药理学结果。一些KOR激动剂在小鼠中不诱导条件性位置厌恶(CPA),与内源性和经典激动剂相反。大脑中蛋白质、细胞和神经通路水平的异质性阻碍了体外-体内相关性。因此,当务之急是开发一种方法,直接研究体内GPCR(特别是KOR)信号。因而作者应用磷酸化修饰定量蛋白组技术,进行小鼠脑G蛋白偶联受体信号的研究。发现mTOR途径在与厌恶相关的激动剂中富集,KOR激活期间的mTOR抑制消除了厌恶,同时保留了治疗性镇痛和抗惊厥作用。研究结果确立了高通量磷酸化蛋白组学作为研究体内GPCR信号传导的一般策略,能够预测和调节行为结果。
富集策略:
TiO2富集磷酸化肽段
搜库软件:
MaxQuant
分析策略:
Interaction network analysis,Categorical enrichment analysis,KEGG analysis
研究路线:
蛋白质组学
实验流程图
 
生信分析:
 
蛋白质组学
 
       
部分应用文献:
[1] Wanda M,Waterworth,Michael Wilson,et al. Phosphoproteomic analysis reveals plant DNA damage signalling pathways with a functional role for histone H2AX phosphorylation in plant growth under genotoxic stress [J]. J Proteomics,2019;1007-1021.
[2] Yu Shi,Weina Gao,Peiwu Huang,et al. Targeting LIF-mediated paracrine interaction for 
pancreatic cancer therapy and monitoring [J].Nature,2019;131-135.
[3] Fraser KB,Moehle MS,Alcalay RN,et al. Targeting Urinary LRRK2 phosphorylation predicts parkinsonian phenotypes in G2019S LRRK2 carriers[J]. Neurology, 2016;86(11).
[4]Sun YN,  Huang JQ,  Chen ZZ,et al. Amyotrophy Induced by a High-Fat Diet Is Closely Related to Inflammation and Protein Degradation Determined by Quantitative Phosphoproteomic Analysis in Skeletal Muscle of C57BL/6 J Mice[J]. J.Nutr.,2020;150(2).
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