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代谢流组学(Metabolic Flux Analysis)检测

代谢流组学(Metabolic Flux Analysis)检测分析方案
项目简介
1.1代谢流分析概述
为了深入了解细胞代谢过程,我们采用各种组学工具包括基因组学、宏基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学进行分析。但由于这些组学技术目前无法充分反映转录后调控、酶活性及细胞过程。于是提出了代谢流组学(Fluxomics)来全面研究所有代谢物的流率(flux rates),这样就可以很好的在生理上描述细胞的代谢活性。
基于13C或者15N标记的代谢流量分析方法能够系统地定量细胞或者组织内代谢网络的流量分布及各代谢途径的相对贡献,即通过13C标记实验并结合2D-NMR波谱或GC-MS色谱信息来分析细胞内中间代谢物的13C标识状态,从而系统地定量细胞内的各个代谢流量的相对大小及其分布变化,其优点是可以利用细胞内代谢物的质量同位体信息的分析方法,不但在很多情况下能够直观地表明代谢流量的整体走向,而且通过计算能够准确定量地揭示细胞内各个代谢反应的活性,以及深入理解平行反应、可逆反应等多种复杂的细胞内代谢过程,直观揭示细胞胞内的主要活性途径及各个途径的相对贡献及其分布变化特点,从而鉴定出相关疾病发生发展过程的早期诊断的标志物及其关键的主要代谢通路,并揭示其相互调控规律,为疾病发生的临床早期诊断、药物靶点治疗和预后判断提供强有力的科学依据。
代谢流分析可以解决如下几个问题:
通过比较不同环境条件及各种代谢性疾病的不同代谢途径的代谢流量的分布变化,揭示出相关疾病发生发展过程中的主要代谢通路及其早期诊断的标志物。
通过13C代谢流量技术对胞内外的中间代谢物的变化示踪,可以鉴定出基因工程菌的关键的代谢通路和活性,为更大程度提高目标代谢产物的合成提供直接的依据。

可以比较分析细胞,组织及其血样和尿液在基因改造的前后的代谢功能变化。

图1. 赖氨酸合成途径与野生型途径的代谢流差异


目前我公司可供选择的代谢流分析方法有:
基于13C 标记的葡萄糖(Glucose)碳代谢流分析
基于13C标记的谷氨酰胺(Glutamine)碳代谢流分析




图2. 13C标记的谷氨酰胺碳代谢流网络示意图


基于15N标记的谷氨酰胺(Glutamine)氮代谢流分析
非靶向代谢流分析


图3. 葡萄糖及谷氨酰胺代谢网络图


目前我公司代谢流分析技术路线图如下:

图4. 13C代谢流分析技术路线


1.2实验设计
本课题拟采用小鼠心肌细胞作为研究对象,分有氧培养和无氧培养两组,每组6个平行样品,利用13C全标记的葡萄糖代谢流分析的方法研究其TCA,糖酵解途径的代谢功能变化。
样品详情:共计12例样品。


1.3分析内容
基础数据分析包括:数据预处理,代谢流通量分析,代谢流差异分析,层次聚类分析, Bi-plot分析。
1.4检测平台
代谢流分析检测平台:Orbitrap LC-MS,UHPLC-QQQ-MS,GC-Q-MS(根据项目需求选择合适的平台)


二、数据分析方案
基础数据分析
2.1数据预处理
首先收集GC-MS(a-d图)的代谢物的峰图和同位体的信息,获得代谢物的同位体信息。


图5. 总离子流(TIC)色谱图及质谱信息


2.2 代谢流通量分析
我们运用是基于Matlab基础的专业代谢流分析软件Matlab flux-8 ,我们采用此分析软件进行代谢流分析,此分析软件将原先复杂繁琐的矩阵计算过程模块化,界面化,使用户能够直观地构建代谢网络,并能快速的进行代谢流分析。由于各元素的稳定同位素在自然界都稳定存在并占一定的比值,因此对各片段进行自然丰度校正,并计算各片段的质量同位体分布矩阵(MDV)。
首先,直接鉴定出每个化合物的同位体的分布信息如下部分数据:

表1. 化合物同位体分布及标记度分析


然后,计算出不同样品胞内外途径中各个代谢物来自标记碳源的13C flux ratio:

表2. 不同样品13C flux ratio


2.3代谢流差异分析

首先,根据13C Flux ratio的数据,经过Normalization (Log Transformation)处理后,做Fold Change Analysis,或者T-test检验分析,鉴定出代谢网络中发生代谢变化pathways的关键代谢物的13C Flux ratio的变化,揭示其相应途径的酶活性发生显著性变化。例图如下图所示(大肠癌中关键serine 合成途径发生了明显变化,针对该途径基因改造前后,比较分析其途径中其13C Flux ratio的变化):

图6. 不同样品间各化合物13C Flux ratio

Cell, 152, 599–611, January 31, 2013

2.4 差异化合物层次聚类分析

Flux ratio有差异的化合物进行层次聚类热图分析,如下图通过分析其实验组和对照组的代谢途径的关键代谢物的变化,揭示其代谢通路及其酶活变化。

图7. 差异化合物层次聚类图

Cell,166, 1324–1337 August 31, 2016

2.5 Bi-plot分析

对所有数据进行Bi-plot分析能从总体上反应各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小,同时可以直观地观察样品和代谢物之间的关系。使用SIMCA软件(V14.1, Umetrics, Umea, Sweden)对数据进行UV格式化(Unit Variance Scaling)和平均中心化(Mean-Centered)处理,以获得更加可靠且更加直观的结果。软件进行自动化模型拟合分析,获得可靠数学模型的主成分数目。例图如下所示:

图8. Bi-plot分析


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