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阿趣生物助力预测肝癌治疗关键靶点,或成治疗新策略

分类:
阿趣动态
发布时间:
2020/06/18 10:48
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肝癌是全球第六大肿瘤,排在因癌症疾病死亡的第四位。2015年,全世界肝癌发病85.4万例,死亡81万人,半数病例和死亡发生在中国。肝细胞癌占原发性肝癌的75%-85%。虽然肝癌的诊断和治疗已经取得进展,但治疗后5年生存率仍为25%-39%,晚期肝癌患者的复发率约为80%。因此,迫切需要了解肝癌进展和转移的机制,这将有助于制定治疗方案,同时延长肝癌患者的生存期。 
 
近期发表在Hepatology杂志,IF=14.97,标题为PGC1α suppresses metastasis of HCC by inhibiting Warburg effect via PPARγ-dependent WNT/β-catenin/PDK1 axis的文章。研究并探讨了PGC1α对肝癌预后的影响,并发现PGC1α可能是肝癌患者的候选治疗靶点,有望为肝癌治疗提供新思路。
 
接下来让我们一起看看详细的研究内容。重编程代谢是癌症进展的重要标志之一。有氧糖酵解,也被称为沃伯格(Warburg)效应,是肿瘤细胞最具特征的代谢表型。相关证据表明,糖酵解不仅是由缺氧条件导致的,也可能是致癌信号。然而,有氧糖酵解在肝癌中的作用和分子机制尚不清楚。过氧化物酶增殖物激活受体γ-辅激活因子-1α(PGC1α)它是一个小的转录辅激活因子家族的成员,主要促进线粒体的生物生成和呼吸作用。在HCC中,PGC1α的表达水平较低,但PGC1α在HCC疾病进程中和有氧糖酵解中的生物学功能和分子机制尚不清楚。
 
研究人员收集了肝癌患者的癌组织及癌旁组织,在3年间进行PCR,Western blot ,免疫组化(IHC)实验,同时还进行了队列分析。分析结果显示TCGA(n=50)和GSE14520(n=214)队列研究分析中,发现PGC1α在肝癌中下调(图1A)。采用实时PCR技术对65例肝癌组织及癌旁组织中PGC1α的表达水平进行检测。如图1B-C所示,与相应的非肿瘤肝组织相比,肿瘤组织中PGC1α的mRNA水平降低了72.3%。western blot(图1D)和IHC分析进一步证实PGC1α下调。
 
 
代谢组学
1A:TCGA和GSE14520队列研究中PGC1α含量的变化情况; 1B-C:qPCR检测肝癌组织及癌旁组织中PGC1α的表达水平;1D: Western blot分析
 
 
为探讨PGC1α在肝癌组织中下调的临床意义,对233例肝癌患者的组织芯片(TMAs)进行了免疫组化实验,图1E显示根据免疫组化结果将233例肝癌患者分为两组:PGC1α高表达组(n=126)和PGC1α低表达组(n=107)。生存分析显示,PGC1α表达水平低的肝癌患者总生存率(OS)(P=0.0002)和复发时间(TTR)(P=0.0328)低于PGC1α水平高的患者(图1F)。由此猜测PGC1α可能是预测肝癌患者预后情况的一个有价值的因素。
 
 
代谢组学
1E:肝癌患者的免疫组化分析;1F:生存实验统计分析
 
 
为了探讨PGC1α在肝癌细胞中的生物学功能,研究人员建立了PGC1α在HCCLM3和MHCC97H细胞系中过表达的稳定模型,并建立了敲除PGC1α的模型。移行和侵袭试验表明,PGC1α的过表达显著抑制了HCC细胞的迁移和侵袭性(图2A-B),而PGC1α的敲除显著促进了HCC细胞与对照细胞相比的迁移和侵袭性(图2C)。
 
 
代谢组学
2A-C:PGC1α的过表达和PGC1α敲除后细胞的迁移和侵袭性分析
 
 
此外,为了在体内证实上述发现,研究人员将稳定的细胞株注入裸鼠的侧尾静脉,建立肺转移模型。8周后,与对照组相比,注射PGC1α高表达HCCLM3细胞的小鼠肺转移结节较少(图2D)。相反,PGC1α的敲除显著增加了肺转移结节的数量(图2E)。肺转移结节的大小略有不同,但无显著性差异。此外,肿瘤数据挖掘和临床样本显示,PGC1α的表达量在肝癌发生过程中逐渐减少。这些结果提示PGC1α在体内外均能抑制肝癌细胞的迁移和侵袭,可能在肝癌的发展和转移中起到抑癌作用。
 
 
代谢组学
2D-E:肺转移动物模型组织切片分析肺转移结节数量分析
 
 
之前有报道称,PGC1α在几种癌症的发展过程中参与了重编程代谢。研究者假设肝癌细胞中PGC1α的抑瘤活性伴随着一个整体的代谢重编程。为了验证这一假设,研究者使用超高效液相色谱-质谱法(UHPLC-MS)对HCCLM3细胞进行了代谢组学分析(图3A-B)。UHPLC-MS分析和之后的生化分析显示,三羧酸循环(TCA)和糖酵解因PGC1α过度表达而发生显著改变(图3C-D、3E-F)。
 
 
代谢组学
代谢组学
3A-F:细胞代谢组学非靶检测分析
 
 
同时,研究人员还分别比较了PGC1α高表达或基因敲除的肝癌细胞和对照细胞之间的关键细胞代谢和生物能量参数。结果表明,PGC1α的过表达显著提高了HCCLM3和MHCC97H细胞的基础耗氧率和最大耗氧率(OCR),降低了细胞外酸化率(ECAR)图4A。相反,PGC1α的敲除降低HepG2和SMMC7721细胞的OCR和ECAR(图4B。另外,PGC1α的过度表达导致细胞ATP水平、葡萄糖摄取量和细胞外乳酸水平的降低(图4C),而PGC1α的敲除降低了细胞内ATP水平和葡萄糖摄取量,并增加了细胞外乳酸水平(图4D)。
 
 
代谢组学
4A-D:细胞代谢和生物能量检测
 
 
为了探讨Warburg效应与HCC细胞的进展是否有关,用HCCLM3载体和HepG2-shPGC1α细胞分别使用不同浓度的2-DG处理,结果显示2-DG对HCCLM3载体和HepG2-shPGC1α细胞的糖酵解有明显的抑制作用。HCCLM3载体和HepG2-shPGC1α细胞的迁移和侵袭能力也呈剂量依赖性下降(图4E)。为了证明糖酵解调节肝癌的迁移和侵袭,研究人员在含有半乳糖的培养基中培养细胞,从而减少糖酵解通量,迫使细胞依赖于氧化磷酸化。结果表明,糖酵解通量的减少大大消除了PGC1a基因敲除引起的HepG2细胞迁移和侵袭能力的增加。这些结果表明,PGC1α促进肝癌细胞的氧化磷酸化,同时抑制肝癌细胞的有氧糖酵解(沃伯格效应),PGC1α通过抑制肝癌细胞系的沃伯格效应抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。
 
 
代谢组学
4E:细胞迁移和侵袭验证
 
 
为了进一步探讨PGC1α调节有氧糖酵解的机制,研究人员评估了PGC1α对重要糖酵解酶表达的影响。利用qPCR检测了13种糖酵解酶的mRNA水平,发现除丙酮酸脱氢酶激酶(PDK1)和乳酸脱氢酶(LDHA)外,大多数酶的表达水平没有改变,PDK1的表达水平也基本改变(图4F)。糖异生、氧化磷酸化和肝脏特异性葡萄糖转运蛋白的标记物也通过qPCR进行定量(图4G)。
 
 
代谢组学
4F-G: qPCR检测mRNA水平
 
 
接下来,研究人员探讨PDK1是否参与PGC1α基因敲除调节的糖酵解增加。研究发现,当siRNAs敲除PDK1后,PGC1α敲除诱导的HepG2和SMMC7721细胞乳酸生成量的增加明显减弱。接下来进一步探讨了PDK1在PGC1α介导的肿瘤进展中可能的作用。结果表明,PDK1的沉默逆转了肝癌细胞的迁移和侵袭活性,PGC1α的敲除增强了这种活性。此外,PDK1在体内也可以被PGC1α调节。这些结果提示PDK1是PGC1α调节有氧糖酵解的功能下游靶点,对PGC1α介导的肿瘤进展至关重要。
 
为了弄清楚PGC1α抑制PDK1的机制。研究人员发现WNT信号通路与HCCLM3细胞中的PGC1α显著负相关。采用TOP/FOPFLASH报告法分析PGC1α表达对肝癌细胞WNT/β-catenin通路的影响。发现PGC1α的过度表达显著抑制了HCCLM3细胞中β-catenin的转录活性,而PGC1α敲除后HepG2细胞中TOPFLASH报告活性显著增强(图5A)。同时发现丙酮酸脱氢酶(pSer293 PDH)作为PDK1的靶点,其升高水平也被WNT/β-catenin途径抑制。β-catenin蛋白水平随着PGC1α的过度表达而降低,随着PGC1α的敲除而升高。提示PGC1α通过抑制WNT/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞PDK1的表达。
 
 
代谢组学
5A:HCCLM3细胞中β-catenin的转录活性检测
 
 
PPARγ能够诱导典型WNT/β-catenin途径抑制并促进葡萄糖稳态。因此,研究PGC1α诱导的WNT/β-catenin信号抑制和抗Warburg效应是否是通过PPARγ依赖方式介导的则尤为重要。双荧光素酶报告分析显示,PGC1α过表达的HCCLM3和MHCC97H细胞中PPARγ的转录活性显著上调(图6A)。PPARγ基因敲除逆转PGC1α诱导的WNT/β-catenin信号传导抑制(图6B)。提示PGC1α对肝癌细胞WNT/β-catenin信号传导的抑制作用依赖于PPARγ。
 
 
代谢组学
6A-B: PGC1α过表达及PGC1α敲除的双荧光素酶实验
 
 
接下来在转录组水平上评估PGC1α对HCCLM3细胞整体基因表达模式的影响(图7A)。通过基因集富集分析(GSEA)研究转录组变化对生物功能和途径的变化。结果发现WNT信号通路与HCCLM3细胞中的PGC1α显著负相关(图7B)。提示PGC1α通过抑制WNT/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞PDK1的表达。
 
 
代谢组学
7A: HCCLM3细胞整体基因表达模式分析;7B: 基因集富集分析
 
 
为了探讨PDK1在HCC中的预后价值,实验人员分析了233例肝癌手术切除患者中PGC1α和PDK1的表达。肝细胞癌组织中PGC1α和PDK1的代表性照片如图8A所示。PGC1α高表达的肝细胞癌组织中PDK1的染色较弱,而PGC1α低表达的肝细胞癌组织中PDK1的染色较强。对233例肝癌组织中PGC1α表达量与PDK1表达量的关系进行分析后发现PGC1α表达与PDK1表达呈现显著负相关(图8B)。研究人员还分析了233例肝癌组织中PGC1α和PDK1表达水平的预后价值。Kaplan-Meier分析显示PGC1α高表达和PDK1低表达的肝癌患者OS最高,复发率最低(图8C)。结果提示PDK1在PGC1α介导的肝癌进展中起作用。
 
 
代谢组学
8A: 肝癌手术切除患者中PGC1α和PDK1的表达量分析;8B:PGC1α表达与PDK1表达相关性分析;8C: 预后分析
 
 
综上所述,在本文中首先研究了PGC1α在肝癌转移和代谢中的作用和机制。PGC1α通过抑制WNT/β-catenin途径下游靶点PDK1的有氧糖酵解抑制肝癌细胞的体内外转移。PGC1α对WNT/β-catenin通路的抑制作用依赖于PPARγ。本文阐明了PGC1α作用的新见解,并提示PGC1α可能是肝癌新治疗策略的一个有希望的靶点。
 
 
文章延伸
 
阿趣生物为本研究提供了LC-MS非靶标代谢组学检测分析服务。
 
通过液质联用(LC-MS)方法检测生物体受外界刺激前后体内大多数小分子代谢物的动态变化,重点寻找在实验组和对照组中有显著变化的代谢物,进而研究这些代谢物与生理病理变化的相关关系,其研究对象大都是分子量1500Da以内的小分子物质。
 
技术优势:
较高的灵敏度、分辨率; 
较宽的动态范围; 
适合于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标志物的鉴定;
适合对标本中未知代谢物的探索研究。
 
应用方向:
表型和生理功能研究;
疾病病理研究 ;
临床诊断及治疗;
药物研究 ;
中医理论研究;
食品科学与营养学研究;
畜牧与农林业研究;
环境毒理研究。
 
有需要LC-MS非靶标代谢组学检测分析服务的老师,欢迎在文末留言或者垂询服务热线:400-664-9912。
 
参考文献:
Qiaozhu Zuo, Jia He, Shu Zhang, et al. PGC1α suppresses metastasis of HCC by inhibiting Warburg effect via PPARγ-dependent WNT/β-catenin/PDK1 axis. Hepatology 2020 Apr 16.
 
文献下载链接:
链接:https://pan.baidu.com/s/17e4cOW0Ujox8E19iel1NNQ
提取码:cl31
 
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