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文献分享 | 比较全扫描、DDA、DIA三种采集模式在非靶向代谢组学的差异

分类:
阿趣动态
发布时间:
2020/12/11 16:46
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代谢组学

 
非靶向代谢组学正在成为一种强大而有吸引力的技术,已被广泛应用于许多研究领域,全扫描(full-scan)、数据依赖采集(DDA)和数据非依赖采集(DIA)是基于高分辨质谱的非靶向代谢组学中的三种常见数据采集模式。全扫描是将代谢物一级和二级分开扫描、所需检测时间较长。DDA中,质谱仪器进行全扫描,然后对从全扫描质谱中选择的母离子(强度依赖)列表进行二级扫描。而理论上,DIA能够对所有代谢物的MS2信息进行连续和无偏倚的采集。但由于其MS2质谱信息十分复杂,母离子和子离子关联不紧密,数据处理存在困难。
 
代谢组学
 
由于每种数据采集模式的独特性和局限性,所以我们有理由相信数据采集模式的选择可能会影响代谢组学结果的质量。作者使用标准品混合物和人尿分别在RP(+)和HILIC(-)中进行实验。实验结果表明全扫描模式能够获得最多的peak,其次是DIA和DDA。比较DIA和DDA中的MS2谱图,DDA中的MS2谱图的质量更高,DIA中MS2谱图的数量更多。此外,相对标准偏差结果显示,DDA在定量准确度上缺点不明显,三种采集模式具有一致性。就数据预处理的便利性而言,DDA是三种方法中最方便的,它可以从peak提取到代谢物的鉴定实现完全自动化,并将基于全扫描的工作流程从天缩短到小时。在处理DIA数据时仍需要解决一些生物信息学问题,并且迫切需要开发更有效的计算程序。
 
结果
 
代谢组学
 
 
图1.比较非靶向代谢组学中全扫描,DDA和DIA模式的示意图工作流程
 
全扫描(full-scan)、DDA和DIA综合评估的工作流程示意图如图1所示。在这项研究中,研究人员测试了134种标准品混合物(StdMix)和1份尿液样本(Urine)(原始浓度和100倍稀释)。LC-MS分析在RP(+)和HILIC(-)中进行,收集数据后,对三种数据采集方式进行peak数量、定量精度、MS2质谱的数量和质量以及便利性等五方面进行比较。
 
表1.通过三种数据采集方法分析的标准混合物中确认的代谢物数量
 

代谢组学

* StdMix(L)中检测到的代谢物与StdMix(H)中检测到的代谢物及相应百分比
 
首先研究人员人工核查标准品的保留时间、准确分子量和MS2 谱图后,从表1的结果中显示,在RP(+)和HILIC(-)模式下,原始标准混合物(StdMix(H))在全扫描和DIA中确认的代谢物数量始终比DDA中略高。为了评估不同数据采集模式检测低丰度代谢物的能力,研究人员使用稀释的标准混合物(StdMix(L))进行了重复分析。研究人员在RP(+)和HILIC(-)分析中,发现与预期的一样,StdMix(L)检测到的代谢物数量比StdMix(H)显著减少。与StdMix(H)结果相比,全扫描同样检测到了最多的代谢物数量,但DDA在被识别的代谢物数量中下降最大,在检测低丰度代谢物方面DDA不如全扫描和DIA灵敏。
 
接下来、研究人员进一步在全扫描、DDA和DIA 模式下对人类尿液样本进行非靶向分析。使用MS-DIAL软件对尿液样本中的peak提取、比对数据和代谢产物初步鉴定。数据处理参数手动优化,以达到最佳peak提取性能。
 
 

代谢组学

 
图2.在(A)RP(+),(B)HILIC(-)分析中通过三种采集方法分析的尿液样品中检测到的总peak数量、MS1注释和MS2匹配的peak数量。
 
研究人员为了评估三种数据采集模式的分析差异,计算了检测到的MS1注释和MS2匹配的peak的总数(图2)。在RP(+)和HILIC(-)分析中,无论尿液样本浓度如何,全扫描和DIA模式比DDA模式能够覆盖更多的peak。
 
 

代谢组学

图3.(A)RP(+),(B)HILIC(-)分析中的peakMS信号强度的RSD分布。
 
除了检测到的peak的数量,研究人员还对尿液样本进行了技术重复(一式三份)。经MS-DIAL峰校准后,计算peak强度的相对标准偏差(RSD)。如图3所示,三种采集模式结果中大于80%的peak 的RSD均小于 20%,且在全扫描和DIA中准确度极佳(RSD < 5%)。这一趋势在不同浓度尿液样本分析中结果是一致的。DDA始终具有最小的peak百分比(RSD < 5%),且与样品类型、浓度、电离极性或色谱方法无关。说明DDA的定量准确度略低于全扫描和DIA。
 
 

代谢组学

 
图4.(A)RP(+)(B)HILIC(-)分析尿液样品中DDA和DIA检测到的MS2重叠特征
 
利用人类尿液样本,研究人员比较了DDA和DIA模式下产生的MS2质谱的数量和质量。在 Urine(H)-RP(+),Urine(H)-HILIC(-), Urine(L)-RP(+), Urine(L)-HILIC(-)分析中,DDA模式下平均有43%的peak具有相应的MS2谱图。DIA分析中100%的peak具有相应的MS2质谱图。此外,DDA和DIA结果中的具有MS2质谱的共同peak以Venn图显示(图4)。如图所示,DIA比DDA能够生成更多的MS2质谱图。但是,研究人员发现DDA可以生成一些DIA中没有找到的峰形较差、丰度较低的MS2谱图。
 
 

代谢组学

图5. RP(+)和HILIC(-)分析中,DDA与DIA的质谱相似性得分分布。
 
除了MS2谱图数量的比较,研究人员还评估了由DDA和DIA分析产生的RP(+)和HILIC(-)分析产生的Urine(H)MS2谱图的质量。DDA和DIA检测到的所有常见peak的Dot product score、该数值的大小与谱图质量呈正相关。分布如图5所示。由于代谢浓度不同,MS2谱图的分布与代谢物标准相似,且有几种代谢物匹配点积得分极低。DDA和DIA的点积分数分布结果表明,DDA产生的MS2质谱具有更好的分数,因此得到更好的谱图质量。
 
 

代谢组学

图6.三种数据采集方法评估的总结
 
研究人员对非靶向代谢组学中全扫描(full scan)、DDA和DIA模式进行了综合评估。每种数据采集模式都有其独特性和局限性,会显著影响代谢组数据的质量。总的来说如图6所示,(1)全扫描peak数量最多,其次是DIA和DDA。(2)因结果中超过80%的peak 的RSD低于20% 在LC-MS中是可以被接受的,故这三种采集模式的定量准确度具有一致性。(3)在DDA和DIA这两种能够得到MS2谱图的采集模式相比,DIA的MS2谱图数量高于DDA,但DDA的MS2谱图质量高于DIA。另外,DDA具有使用方便、可以自动化进行鉴定、缩短工作流程时间的特点,在非靶代谢组学中十分具有竞争力。
 
百趣生物作为代谢组学科技服务领域的开拓者与领军者,一直以来在非靶向代谢组学中使用DDA采集模式,为客户提供优质高效的技术服务。
 
 

代谢组学

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