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样本收集手册 | 细胞和细胞培养液的收集方法及注意事项

分类:
阿趣动态
发布时间:
2021/03/26 09:27
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各位科研人,今天我们将给大家带来细胞和细胞培养液的收集方法及注意事项。细胞作为生物代谢活动的起点场所,在代谢组学中的重要性不言而喻。细胞代谢也必然会影响到细胞生存环境——细胞培养液。近年来,以细胞为模型来探究疾病生物标志物以及疾病致病机制的科研活动越来越多。因此,样本收集方法就显得格外重要,结合我“趣”九年的实践经验,就细胞和细胞培养液的收集方法及注意事项为大家娓娓道来。
 
1
细胞样本
 
样品量要求:
1*107 cell/sample,提供两份样本,其中一份作为备份,分两管盛放。
 
淬灭试剂准备:
称取85g AMBIC(碳酸氢铵)加入到1000ml超纯水中,得到85g/l的AMBIC溶液。然后量取600ml 甲醇,100ml AMBIC (85g/l),290ml 超纯水水,混合,用12M 盐酸调节pH至7.4,最后用超纯水定容至1L即可。
 
注意:由于pH的变化,淬灭试剂最好现配现用。
 
悬浮细胞[1]
 
样本收集步骤:
1. 对细胞进行计数,计算1*107个细胞所需要的体积(即1体积);
2. 取5体积的淬灭试剂于试管中(试管的体积应为大于等于7体积),置于-20℃预冷;
3. 快速从细胞培养液中取出1体积的细胞,放入含有淬灭试剂的试管中;
4. 轻微震荡试管10s,在1000g,4℃下离心1min,若细胞较小或细胞未沉淀,可适当加大转速或延长离心时间,但不宜一次提升太多,以防止细胞破损;
5. 除去上清;
6. 将细胞放入液氮,30s后取出置于-80℃保存。
 
贴壁细胞
 
酶消化法[2]
 
样本收集步骤:
1. 除去细胞培养基,迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞,清洗两次;
2. 除去 PBS 溶液(一定要将 PBS 去除干净,越快越好);
3. 消化:加入胰酶,消化至部分细胞呈球状;然后加入培养基,轻轻晃动,使培养基浸润细胞终止消化,吸出剩余培养基;加入 PBS 吹打,悬浮细胞;
(目的是把贴壁细胞消化下来,方便后继处理,加入的溶液量及孵育时间可以根据自己实验室具体情况进行修改);
4. 快速计数,取1*107个细胞所需要的体积(即1体积);
5. 快速放入预冷的5体积的淬灭试剂中,轻微震荡离心管 10s;
6. 转子-20℃预冷,在 4℃,1000g 条件下离心 1min,若细胞较小或未沉淀,可适当加大转速或延长离心时间,但不宜一次提升太多,以防止细胞破损;
7. 除去上清,将细胞放入液氮中,30s 后取出保存在-80℃中。
 
刮细胞法(针对很难用酶消化下来的贴壁细胞)[2]
  
样本收集步骤:
1. 除去细胞培养基,迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞,清洗两次;
2. 除去 PBS 溶液(越快越好);(不能计数的话,建议测代谢物之前做蛋白定量)
3. 加入5体积淬灭试剂淬灭后用细胞刮分离细胞,将刮下的细胞转入离心管中;
4. 在4℃,1000g 条件下离心 1min 去除上清。
5. -80℃保存,干冰运输。
 
注意事项:
1. 取对数生长期,培养至同一时期的细胞,建议多准备样本,以备后续使用;
2. 液氮处理细胞时,注意防止离心管破碎导致样本受损;
3. 为防止样本收集过程中细胞膜破裂,建议在全程操作不宜过度剧烈,切勿涡旋震荡、高速离心或超声等,同时避免反复冻融,以保证细胞膜不会破损,减少代谢组学分析影响;
4. PBS清洗时,切勿冲走细胞,清洗充分后,尽量将PBS完全倒掉。
 
收集方法参考文献:
[1]Christopher A Sellick, Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling, nature protocol, 2011.
[2]Rahul Vijay Kapoore, Cell line dependence of metabolite leakage in metabolome analyses of adherent normal and cancer cell lines, metabolomics,2015
 
2
无需淬灭剂细胞样本收集方法
(备选方法,一般不建议使用)
 
悬浮细胞[1,2]
 
样本收集步骤:
1. 收集细胞并记数,1*107 cell/sample。
2. 将收集的细胞进行4℃离心,5min,1200rpm。
3. 使用PBS洗涤细胞,并在900rpm条件下离心。重复三次,去除PBS(尽量将PBS去除干净)
4. 将含有细胞的EP管,迅速放入液氮中30s。
5. 放入-80℃冰箱保存。干冰寄送。
 
贴壁细胞
 
刮细胞法[3]
 
样本收集步骤:
1. 将细胞用PBS进行多次清洗。
2. 用细胞刮将细胞刮入微离心管中。
3. 将EP管迅速放入液氮中30s,然后进行冻干。
4. 在-80℃冰箱保存。干冰寄送。
 
酶消化法[4]
 
样本收集步骤:
1. 除去细胞培养基,迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞,清洗两次。
2. 除去 PBS 溶液(一定要将 PBS 去除干净,越快越好)。
3. 消化:加入胰酶,消化至部分细胞呈球状;然后加入培养基,轻轻晃动,使培养基浸润细胞终止消化,吸出剩余培养基;加入 PBS 吹打,悬浮细胞;(目的是把贴壁细胞消化下来,方便后继处理,加入的溶液量及孵育时间可以根据自己实验室具体情况进行修改)。
4. 快速计数,取 1 体积的细胞。
5. 转子-20℃预冷,在 4℃,2500g 条件下离心 5min。
6. 去除上清,迅速放入液氮速冻30s,-80℃保存。干冰寄送。
 
收集方法参考文献:
[1]Dehui Xu, Yujing Xu et al. Alteration of metabolite profling by cold tmospheric plasma treatment in human myeloma cells. Cancer Cell Int. 2018
[2]Zuzana Racovaa, Eva Anzenbacherova,et al. Metabolite profiling of natural substances in human: in vitro study from fecal bacteria to colon carcinoma cells (Caco-2). Journal of Nutritional Biochemistry. 2020
[3]Sarah Hayton, arth L. Maker et al. Experimental design and reporting standards for metabolomics tudies of mammalian cell lines. Cellular and Molecular Life Sciences. 2017
[4]Katja Dettmer,Nadine Nürnberger et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 2011.
 
3
细胞培养液
 
样品量要求:
200μL/sample,提供两份样本并分 2 个离心管存放(条件允许最好 500μL/sample)。
 
样本收集步骤:
1.将培养液摇匀,快速从培养瓶中取出一定量的培养液,4℃条件下离心(1000g,10min);
2.移取上清 500μL 至新的离心管中, 迅速放入液氮中淬灭,30s;
3.淬灭后放入-80℃中保存。
 
注意事项:
寄送样本时请放入足量的干冰以保持低温条件【经验值:快递途中干冰消耗率约为 5KG/天,消耗速度与气温,泡沫箱厚度(>5cm)有直接关系,请酌情添加干冰】。
 
收集方法参考文献:
[1]Silas G.Villas-Boas, Extracellular metabolomics: A metabolic footprinting approach to assess Wber degradation in complex media , Analytical biotechnology, 2005.
[2]Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69. 
[3]Farhana R. Pinu, Analysis of Intracellular Metabolites from Microorganisms: uenching and Extraction Protocols, metabolites, 2017. 
 
最后附上我们公司协助客户发表的以细胞和细胞培养液为样本发表的文章,各位老师在发表文章的时候也可以参考一下。
 
1. 上海市肿瘤研究所:Qiaozhu Zuo, Jia He, Shu Zhang, et al. PGC1α suppresses metastasis of HCC by inhibiting Warburg effect via PPARγ-dependent WNT/β-catenin/PDK1 axis. Hepatology 2020 Apr 16. IF=14.971
 
2.中山大学:Qian Cao, Dan-Jie Zhou, Zeng-Yin Pan, et al. CAIXplatins: highly potent Pt(IV) prodrugs selectively against hypoxic tumors via microenvironment and metabolism regulation. Angewandte Chemie International Edition 2020 June 17. IF=12.959
 
3. 第三军医大学附属西南医院:Ou J,Peng Y,Yang W,et al.ABHD5 blunts the sensitivity of colorectal cancer to fluorouracil via promoting autophagic uracil yield. Nat Commun 2019 03 06;10(1). IF=12.353
 
4. 陆军军医大学:Wei Xiang, Rongchen Shi, Xia Kang, et al. Monoacylglycerol lipase regulates cannabinoid receptor 2-dependent macrophage activation and cancer progression. Nat Commun 2018; 9:2574. IF=12.353
 
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