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组学结果没验证就投稿?草率了吧!

分类:
阿趣动态
发布时间:
2021/05/12 10:52
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科研界现在流行一句话:组学结果不验证,reviewer不发通行证。早些年,组学结果验证可是文章的高配,这些年,组学结果验证已逐渐成了文章的黄金标准。各位大佬们千万不要抱有侥幸心理,因为后续补充验证结果真的很难。
 
急!急!急!我的转录组测序结果出来了,要不要做验证?那么多的基因应该怎么选呢?验证结果对不上怎么办?好迷茫...................
 
淡定,今天小趣就和您一起学习学习。其实转录组结果的验证方法还真不少呢(如表达量验证、亚细胞定位、RNA结合蛋白、功能验证等),今天我们主要了解一下表达量验证之QPCR。
 
1
基因如何选?
 
首先表达差异较大的,结果比较可靠。差异倍数也可以根据生物学重复适当调整,比如三个重复的差异倍数在2倍以上,5-10个重复的差异倍数可以适当降低,其次选择与你研究内容相关的差异基因去验证。另外,应当避免选择表达量过低的基因;一般在有生物学重复的情况下,要求组内三个生物学重复的read count≥10;FPKM值至少在一个组大于1。当然了验证基因的数量也不能太少哦。
 
2
样本怎么办呢?
 
基因选好了,我们再来看看样本。是不是随便拿一些样本就可以?NO,NO,NO。RNA的表达具有时间、空间的特异性。不同时刻或者是同一时刻不同组织内RNA表达的数目差异是很大的,不同批次样品的RNA表达也会有所不同,并且即使是同一批样本,保存时间和方式对RNA也是有一定的影响。所以当转录组测序结果出来后应尽快安排验证工作,后续验证的RNA也要与做转录组的RNA来源保持一致。
 
3
引物设计又一大难点 
 
基因选好了,样本也OK了,是不是就可以高枕无忧了?别急,要想验证结果可靠,引物设计也是门学问。引物的GC含量要在40%~60%之间;Tm值60℃最好,上下游引物Tm值相差最好不超过2℃;扩增产物长度在80-150 bp之间最佳;避免出现二级结构和非特异性扩增;引物尽可能设计在基因的转录本共有外显子上;引物设计好以后可以到NCBI-Primer Blast,进行特异性检测,避免扩增假基因。实在不行您把序列发我,麻烦事就让我做吧。我司可免费帮您做引物设计,后台回复:“引物设计+姓名+单位+联系电话”即可。
 
4
QPCR检测——漂亮的结果总该出现了吧
 
前期工作准备的差不多了,可以开始QPCR检测了。啥?QPCR检测原理您还不清楚?尴尬呀。Real-time PCR技术(QPCR):利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。优化实验方法【扩增效率(90%-105%),3个技术重复不能少哦,且RSD<0.2】;最好是找专业的技术人员,否则结果用不了,不仅浪费样本,关键还影响发文章呀。这里有其他小伙伴做的QPCR结果供各位老师参考:代谢组学,各位老师可以瞧一瞧,如果您刚好有需求……嘿嘿,欢迎后台咨询哦~
 
最后还要提醒一下各位,转录组测序与QPCR定量虽然都看基因表达,但是他们却是两种不一样的方法,会有很大概率的不一致,要做好心理预期。如果您还想做功能验证的话,小趣这里有基因功能研究锦囊哦:代谢组学
 
祝您早日告别验证烦恼,登上科研巅峰。
 
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