发表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
发表时间：2021.12.30
影响因子：6.292
合作客户：中国林科院亚热带林业研究所
百趣生物提供服务：TMT标记定量蛋白组
分组：CdCl2处理组（4d,n=3）/对照组（0d,n=3）
研究背景
镉（Cd）是对中国土壤安全威胁最严重的重金属污染物之一，可与植物必需元素竞争并转移到地上组织。它能引起植物DNA损伤，产生活性氧自由基，影响植物的生长和发育。伴矿景天（Sedum plumbizincicola）是具有镉超富集能力的植物之一，能在地上部组织中积累大量镉元素而不呈现毒害症状，在土壤重金属污染治理中具有重要应用价值。然而，调控这一过程的分子机制还不完全清楚。作者首次应用TMT定量蛋白质组技术并结合已报道的转录组学数据，探究伴矿景天对镉的耐受和积累的分子机制。
实验材料
伴矿景天的幼苗在霍格兰氏溶液中生长三周，温度26℃，光照16小时/8小时黑暗周期。幼苗用400μM CdCl2溶液处理4d，以0d为对照组，实验组为4d，每组3个生物学重复。
研究结果
1 差异表达蛋白（DAPs）的蛋白质组学分析和鉴定
TMT定量蛋白组实验共鉴定6064种蛋白质，其中可定量蛋白6024种。按照FC>1.5，p<0.05卡值标准，共筛选出630个差异表达蛋白（DAP）。其中，有289个上调蛋白和341个下调蛋白。GO和KEGG分析表明代谢过程、细胞过程和单有机体过程占比分别为38.73%、31.27%和22.70%。 此外，KEGG途径分析发现苯丙烷生物合成、内质网中的蛋白质加工和次级代谢产物的生物合成是DAPs最显著的富集途径（图1）。
图1.TMT定量蛋白组分析结果
2 蛋白质丰度与基因表达的比较分析
在这项研究中，作者进一步分析已发表的转录组数据，共鉴定出40027个基因，其中可定量基因数量为35776个。基因与蛋白质数据相关性散点图分析发现共有5900个蛋白质/基因被分在9个象限中。象限5中的2745个基因在mRNA和蛋白质水平上的表达没有显著差异。象限2和8中的1013和1356蛋白质在mRNA水平上表现出差异表达，但在蛋白质水平上没有差异表达。Pearson的相关性表明，象限3和象限7的DEG之间DAPs变化显著正相关（rpearson=0.796，p值<0.001）。因此，作者的研究集中在象限3和7中共有的差异表达基因（图2）。
图2.差异表达mRNA和蛋白质关联分析散点图
3 共有基因/蛋白质的GO和KEGG分析
对于显著正相关的209种差异指标进行功能分析，生物学过程分析（BP）表明差异蛋白质主要参与代谢过程、细胞过程和单有机体过程；细胞部分和细胞器是其主要定位；分子功能分析也指向催化活性、结合和转运体活性。在镉胁迫处理后，有4个KEGG同源基因（KO）在mRNA和蛋白质水平上显著上调或下调（p值<0.05），包括苯丙烷生物合成、氧化磷酸化、吞噬体和谷胱甘肽代谢。在苯丙烷生物合成途径中，FAOMT和TKPR1上调，PER52、PER9、PER3等下调 （图3）。
4 在东南景天(S.alfredii)中过表达SpFAOMT会增加木质素含量
在镉胁迫下，SpFAOMT在mRNA和蛋白质水平上均显著上调， 其参与苯丙烷生物合成途径，此途径在木质素单体的生物合成中起着关键作用，它可改变细胞壁结合重金属离子的能力，并调节植物的重金属耐受性。因此，SpFAOMT可作为分析其在植物耐镉性和积累中潜在作用的候选基因。作者在东南景天中过表达SpFAOMT基因， 对茎进行木质素组织化学染色，发现用10μM CdCl2处理7天后，在茎的表皮和维管组织中出现木质素沉积。表明SpFAOMT参与木质素生物合成，并且在S.alfredii中过度表达SpFAOMT会增加木质素含量（图4a）。
5 在东南景天中过度表达SpFAOMT可减少Cd的积累
为了进一步研究其在镉的耐性和积累中的作用，测定了转SpFAOMT基因的东南景天叶片、茎和根组织中镉的分布。用10μM CdCl2处理7天后，发现转基因SpFAOMT株系的叶和茎组织中的镉积累量显著低于对照；转基因品系的根组织也显示出略低的镉积累（图4b）。
图4. 转SpFAOMT基因东南景天的功能表征研究小结
在这项研究中，作者联合转录和蛋白质组学分析，研究伴矿景天植物对镉胁迫的反应，并确定可能与镉耐受和积累有关的关键途径。对过表达SpFAOMT的转基因株系进行木质素染色和镉积累分析，揭示了其在镉胁迫下木质素生物合成途径中的作用。这些已鉴定的基因和蛋白质将为研究调节镉胁迫的分子机制提供新的线索和思路。
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