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合作文章 | 转录组学和蛋白组学:假单胞菌耐冷耐药的机制研究

分类:
阿趣动态
发布时间:
2022/03/16 15:09
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文章标题:Transcriptomics and proteomics revealed the psychrotolerant andantibiotic-resistant mechanisms of strain Pseudomonas psychrophila RNC-1capable of assimilatory nitrate reduction and aerobic denitrifification

发表期刊:Science of the Total Environment影响因子:7.963合作客户:北京大学环境科学与工程学院

百趣生物提供服务:label free非标记定量蛋白组和转录组

实验思路

 

图1. 实验流程图

 

研究背景

随着工农业的快速发展,过量的氮被排放到自然水生系统中,引起了水富营养化、水资源短缺和供水安全等问题。最常见的废水脱氮方法是生物处理,通常包括两个步骤:好氧条件下的自养生物硝化和厌氧条件下的异养生物反硝化。但是好氧反硝化细菌在低温下细胞生长和脱氮能力会受到抑制。另一方面,这些化合物及其代谢物不断排放到环境中会导致水生生态系统和污水处理厂中频繁检测到多种抗生素。因此筛选到一株既能耐抗生素和耐冷的胁迫又具有良好脱氮能力的菌株非常重要。

本研究的主要目的是:

  • 评价菌株RNC-1在不同温度(10℃、20℃和30℃)下的好氧反硝化性能;

  • 评价菌株RNC-1对不同抗生素(SMX)浓度(0、0.1、0.5、1.0和5.0 mg/L)的响应;

  • 揭示其耐高温和耐SMX机制。该研究对好氧反硝化菌在废水脱氮中的实际应用具有重要意义。

 

实验结果

一、菌株RNC-1的生长及好氧硝酸盐去除能力

菌株RNC-1在温度为10℃和20℃条件下培养,且暴露于浓度为0、0.1、0.5和1.0 mg/ml的抗生素时,其生长速率没有明显的变化;当暴露于浓度为5.0mg/ml的 SMX下,其生长速率明显收到了抑制(图2a、2b)。当菌株RNC-1在30℃条件下培养,各组细胞的生长速度都非常缓慢,说明菌株RNC-1是一种典型的耐冷菌,高温会对其产生不利影响。

在10℃培养的细胞,暴露在0、0.1、0.5和1.0mg/L的SMX浓度下,硝酸盐的含量在72h内呈线性减少。当SMX浓度为0.5mg/L时,菌株RNC-1对硝酸盐的还原略有促进,当SMX浓度为5.0 mg/L时,菌株RNC-1对硝酸盐的还原有显著的抑制作用(图2d)。

在20℃下培养的样品,SMX浓度为0和0.5mg/L时,在48h内硝酸盐去除率在90%以上。在SMX浓度为0.1mg/L和1.0mg/L时,48h的硝酸盐去除率分别为58.41%和61.50%。在SMX浓度为5.0mg/L时,48h硝酸盐去除率急剧下降至39.17%(图2e、2h)。说明抗生素对菌株RNC-1的硝酸盐的还原有正向促进和负向抑制的作用。

菌株RNC-1在30℃条件下培养,其脱氮能力受到严重抑制(图2c),这也进一步证明了菌株RNC-1无法抵抗环境30℃,因此温度的增加会对耐寒的细菌有负面影响。

图2. 菌株生长及硝化效率

二、氮平衡分析

表1. 不同温度、抗生素浓度下菌株的硝化反应

通过氮平衡分析(表1),探讨了菌株RNC-1对硝酸盐的还原机理。进一步计算菌株RNC-1的对氮的去除效率、好氧反硝化效率和同化硝酸盐还原效率。说明同化作用和好氧反硝化作用是硝酸盐还原的主要途径。

在10℃和20℃条件下,0.5mg/L的SMX作用下,氮被同化的比例分别为50.94%和54.08%,而0mg/L的SMX作用下,氮被同化的比例分别为46.78%和49.58%,表明0.5mg/L的SMX促进了硝酸盐的同化还原。而0.5mg/L的SMX下的脱氮率与0mg/L的SMX相差无几。因此,0.5mg/L的SMX对硝酸盐还原的促进作用可能是由于同化过程的提高,而不是由于异化好氧反硝化作用的提高。5.0mg/L的SMX对菌株RNC-1同化过程的抑制作用显著高于好氧反硝化过程,说明高浓度SMX对菌株RNC-1同化代谢有显著影响。表明同化硝酸盐还原比异化好氧反硝化更敏感。

三、基于转录组学和蛋白质组学的温度对菌株RNC-1的影响

 

图3. PCA

图4. 火山图

图5. 通路分析

图6. PPI分析

通过对三个不同温度下培养的菌株进行转录和蛋白组学的检测,发现温度影响了RNA聚合酶通路,糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、TCA循环、丙酸代谢和精氨酸生物合成等能量代谢相关通路和ABC转运蛋白通路,从而影响了菌株的生长和硝化的能力。

四、基于转录组学和蛋白质组学的SMX对菌株RNC-1的影响


 

图7. PCA

图8. 火山图

图9. 通路气泡图

图10. PPI分析

通过对不同抗生素浓度下培养的菌株进行转录和蛋白组学的检测,发现抗生素的浓度影响了氨基酸代谢,ABC转运蛋白通路和核糖体、氨基酸代谢、细菌趋化、鞭毛组装、糖酵解/糖异生等通路,从而影响了菌株的生长和氮代谢的能力。

五、RNC-1菌株耐高温机理的研究

 

图11. 菌株RNC-1的耐冷机理通路图

本研究发现处于10℃培养条件下的菌株,RNA聚合酶、核糖体蛋白、冷激蛋白、能量代谢、ABC转运和双组分系统均上调表达。菌株RNC-1在T10中能量代谢的上调对该菌株的能量供应和抗低温能力有积极的贡献。TCA循环为呼吸、氨基酸生物合成和一般氮代谢提供了必要的前提条件。此外,ABC转运蛋白通路的上调也与耐寒性有关。有报道称,ABC转运蛋白可以与ATP水解,激活多种底物的转运,并参与多种细胞过程的调控。双组分系统作为细菌响应环境变化的关键途径之一,在低温条件下也发挥着积极作用。

然而,硝酸盐去除率在10℃培养条件下(1.74mg/L·h)远远低于20摄氏度(2.72 mg/L·h)。培养在30℃时,菌株的氧化磷酸化途径明显衰减,此外,细胞外物质向细胞内转移的能力下降,以及鞭毛组合的下调,最终导致30℃时菌株生长和脱氮的恶化。

六、RNC-1菌株对SMX的抗性机制

 

图12. 菌株RNC-1的抗性机制通路图

0.5mg/L的SMX显著促进了氨基酸代谢、ABC转运体和群体感应的途径。细菌群体感应启动子可以在低浓度抗生素的刺激下被激活,这表明磺胺类药物可以作为影响群体感应的信号分子。在0.5mg/L的SMX胁迫下,与蛋白质链延伸因子Tu(EF-Tu)相关的基因TUF的表达量降低。EF-Tu将在细胞受到应激时参与细胞响应环境应激的信号转导过程。但从蛋白质水平上看,受这两个基因调控的蛋白质EF-Tu和延伸因子Ts (EF-Ts)的表达并没有受到抑制,这可能是0.5mg/L的SMX促进硝酸盐还原的另一个原因。

在5.0mg/L的SMX下,菌株RNC-1与叶酸循环相关的基因和蛋白显著下调,表明SMX抑制细菌生长与下调叶酸代谢直接相关。细胞生长也受到了抑制,这进一步证实了高浓度SMX对硝酸盐同化转化的抑制作用。此外,在5.0mg/L的SMX条件下,好氧反硝化略有抑制,这可能与nirS和norB的上调有关。

 

总结

研究了菌株RNC-1在不同温度(10℃~ 30℃)和磺胺甲恶唑(SMX)浓度胁迫(0~5.0mg/L)下的脱氮适应性。菌株RNC-1在10℃时对硝酸盐的去除效果较好,0.5mg/L的SMX的存在对硝酸盐的去除略有促进作用,而5.0mg/L的SMX的存在对菌株RNC-1的脱氮效果有负面影响。SMX胁迫下,硝酸盐同化还原和好氧反硝化共同起脱氮作用,但对同化过程的影响大于好氧反硝化。RNA翻译、能量代谢、ABC转运蛋白和冷休克蛋白的联合上调是应对低温的主要机制,而氧化磷酸化途径的抑制是30℃时生长下降的主要原因。0.5mg/L的SMX时氨基酸代谢和ABC转运蛋白的上调促进了硝酸盐的同化还原,而叶酸循环途径、5.0mg/L的SMX显著抑制糖酵解/糖异生和细菌趋化作用,导致硝酸盐同化和异化还原的恶化。该机理对好氧反硝化菌在氮污染废水处理中的应用具有重要意义。

文献下载链接:

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