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快来围观啦 ! 关于蛋白磷酸化修饰的那些事儿~

分类:
阿趣动态
发布时间:
2022/03/23 17:02
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蛋白质是细胞的功能分子,基因功能的执行者,从核糖体刚翻译出来的蛋白质是没有功能的,需要到达细胞的指定位置(胞内、胞外,和不同的亚细胞器等)并形成特定的空间结构,才能发挥其功能作用。翻译过程会发生不同类型以及水平的蛋白质翻译后修饰(PTMs; 在UniProt数据库中报告了400种以上翻译后修饰种类,真核生物中有326种,细菌中有250种,古生菌中有80种)。PTM在几乎所有细胞过程中都起着至关重要的作用,包括细胞周期、降解、凋亡、细胞信号传导、转录等(图1)。

图1. 翻译后修饰(PTM)种类[1]

既然蛋白修饰扮演者如此重要的角色,那小编就跟大家说道说道了,这次咱先从最常见的磷酸化修饰说起吧。

0技术简介

蛋白质磷酸化(Phosphorylation)是由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基(Ser、Thr、Tyr)上的过程,或者在信号作用下结合GTP,是生物体内一种普通的调节方式,细胞内有超过30%的蛋白质发生磷酸化修饰,在细胞信号转导、调控细胞增殖、发育、分化、凋亡过程中起重要作用。磷酸化通常比其他翻译后修饰受到更大的关注,部分原因是激酶在疾病,尤其是癌症中经常过表达或突变。因此,许多抑制剂和抗体被开发出来对抗激酶的活性。

磷酸化由激酶催化,去磷酸化由磷酸酶作用执行,如图2所示:

图2. 蛋白磷酸化与去磷酸化过程[2]

如此重要的修饰过程,我们如何去更好的进行相关研究呢?

 02 研究方法 

磷酸化蛋白质组学是主要的研究手段, 质谱法是鉴别蛋白磷酸化位点和定量磷酸化变化的关键工具。磷酸化肽段的富集对于成功的磷酸肽MS 分析至关重要。目前富集方法包括TiO2富集方法、抗磷酸酪氨酸抗体、固定化金属亲和层析(IMAC)、化学修饰和强阳离子交换层析(SCX)等。

如图3[3]展示了磷酸化肽段的传统富集方法,它们各有什么优缺点呢?

1、高亲和力的IP抗体可以识别不同氨基酸的磷酸化位点,但每种抗体都对周围的氨基酸有一定的偏向性,因此使用多种抗体进行IP会增加磷酸蛋白质组的覆盖率。

2、二氧化钛(TiO2)制备时间更短,并提供更大的容量。由于该方法利用了与IMAC相同的原理,因此它同样容易非特异性保留酸性非磷酸化肽。

3、IMAC富集方法是基于磷酸基团对Fe3+Zn2+和Ga3+等金属离子的高亲和力。主要局限性在于非磷酸化酸性肽的非特异性保留,将羧酸基团转化为酯可有效消除非磷酸化肽在IMAC柱上的非特异性保留。该方法能够在较低的响应范围内检测磷酸肽。由于不同的金属离子对不同的磷酸化肽亚群富集效率不同,因此可通过对不同金属的多次分析,或通过在单个IMAC富集步骤中混合多种金属离子,获得磷酸蛋白质组的最大覆盖率。

图3. 磷酸化肽段富集方法[3]

最重要的磷酸化肽富集工作完成之后,就可以准备上机检测啦,质谱检测的方法也是多种多样:

0Label free方法:无需标记,不限样本适量,母离子峰强度定量;
0TMT方法:MS2定量准确度高,二级色谱分馏深度检测;
0DIA方法:MS2定量准确度高,重复性大幅度提高,更少缺失值。

如何选择,那就看检测的样本数量以及蛋白含量,样本平行性等等因素啦~

 

0技术应用

最后要跟大家聊的是,修饰组学与其他组学如何搭档,实现数据的升华呢?

修饰组学+常规蛋白组

最常见的是修饰组学与常规蛋白组联合分析,因为从单一组学层面去分析仅能得到一个分子层面的数据,不能说明具体变化的主角是整个蛋白水平还是修饰水平,因此两个组学的联合分析对于系统深入的分子机制研究是至关重要的。

案例:机体昼夜节律调节因子的新发现

PMID:32054765 Science 20200214;367(6479)

昼夜节律(约24小时)在调节日常生理方面起着重要作用。转录因子Bmal1是哺乳动物生物钟的主要驱动因子,是作为机体主要的分子计数器的关键部分。美国宾夕法尼亚大学Akhilesh B. Reddy发现,通过深度TMT蛋白组、磷酸化蛋白组和转录组学研究[4],在Bmal1基因敲除小鼠中,即使没有外界刺激(如光或温度的变化),其也会影响身体的周期变化,预示着生物时钟的其他驱动因素也是存在的。

图4. TMT蛋白组与磷酸化修饰蛋白组技术路线[4]

修饰蛋白组+其他组学

它们两个搭档,可以讲述出更加精彩的故事,比如修饰蛋白组与转录组学联合分析,逐步揭开生命活动机理的神秘面纱:

案例:BET抑制可阻断炎症诱导的心功能不全和SARS-CoV-2感染

PMID: 33811809 Cell 20210415;184(8)

COVID-19冠状病毒疾病患者发生心脏损伤和功能障碍,并增加死亡率。病因尚不明确,但可能是直接的心脏感染和/或炎症引起的功能障碍。为了确定机制和心脏保护药物,作者应用磷酸蛋白质组学和单核RNA测序技术进行研究,最终确定干扰素γ、白细胞介素1β和聚 (I:C)的联合作用诱导心脏舒张功能障碍。

04技术平台

到这里,关于磷酸化的那些事儿小编也聊了差不多啦,最后一点篇幅就来看看百趣磷酸化修饰蛋白组平台的优势吧:

01

方法优化升级,更高深度数据检测,修饰位点鉴定数量大幅度提升;

02

强大的研发团队,多年质谱经验积累,稳居行业领先水平;

03

全方位服务,多角度售后,协助文章发表。

哈哈,老师们现在是不是已经摩拳擦掌,跃跃欲试了呢,样本可以准备起来啦,期待与您的合作~

参考文献:[1] Katie Dunphy,Paul Dowling,Despina Bazou,et al. Current Methods of Post-Translational Modifification Analysis and Their Applications in Blood Cancers[J].  Cancers (Basel) 2021 Apr 16;13(8).[2] Mi Ke, Hainan Shen, Linjue Wang,et al.Identification, Quantification, and Site Localization of Protein Posttranslational Modifications via Mass Spectrometry-Based Proteomics[J]. Adv Exp Med Biol 2016;919.[3] Jesper V. Olsen, Matthias Mann,et al. Status of Large-scale Analysis of Posttranslational Modifications by Mass Spectrometry[J]. Mol Cell Proteomics 2013 Dec;12(12).[4] Sandipan Ray, Utham K. Valekunja1, Alessandra Stangherlin,et al.Circadian rhythms in the absence of the clock gene Bmal[J].Science 2020 02 14;367(6479).

文献下载链接:

https://pan.baidu.com/s/1fAZtEyAshfNaV-LJaB49tA

提取码:1567

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