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技术介绍 | 定量蛋白组学产品如何选择:iTRAQ/TMT or Label free or DIA?

分类:
阿趣动态
发布时间:
2022/04/05 10:29
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定量蛋白组学产品如何选择:iTRAQ/TMT, Label free or DIA?

一、原理不同

iTRAQ/TMT

iTRAQ/TMT分别由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术,采用多种同位素的标签,可与氨基(包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基)反应实现连接,通过高精度质谱分析,同时实现多个样本蛋白组的定性和定量。iTRAQ/TMT试剂由三部分组成:报告基团、平衡基团和反应基团。反应基团形成2-16种等质量同位素标签。iTRAQ/TMT试剂标记酶解后的肽段的N端及赖氨酸侧链氨基。在MS/MS分析中,每个同量异序标签都能够产生一个独特的离子图谱,因此可以利用该标签进行定量。在一级质谱分析中,标记的多肽是无法彼此区分出来的;然而,在二级质谱模式下,报告基团、平衡基团和反应基团之间的键断裂,带不同同位素标签的同一肽段产生质量不同的报告离子。通过比较二级谱图中的不同报告离子的强度就可以对蛋白进行定量

Label Free

非标(Label free)蛋白质组定量技术是一种不依赖于同位素标记的蛋白质定量技术,该技术通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析,分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,对被检测到的母离子峰强度进行积分,以积分面积进行相对定量

 

DIA

数据非依赖型的扫描模式(Data-independent acquision,DIA)是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式。它是对传统shotgun分析(采用DDA模式,Data Dependent Analysis)的一种改进技术,能够对复杂样品中的所有信号进行无偏向性的MS分析,从而获得更高的肽段覆盖率。DIA扫描模式将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口,高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测,从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。

 

 

二、哪些样本适合做TMT标记定量蛋白组?

 

1、平行性要求

由于标记定量实验涉及到样本的混合后分12个组分上机,相当于1个样本被检测了12次,因此鉴定深度更深,质谱仪同一时间点检测多个样本的同一肽段,因此对样本的平行性有一些要求,平行性越好,检测的结果越多越准确。

 

2、样本类型

通常,组织、细胞等类型的样本适合做TMT,这些样本的特点是:代表的是该样本类型整体的蛋白表达情况,通常种类较多,蛋白种类差别不会很大,平行性较好。相对来讲,一些个体差异较大,蛋白种类较少的样本:比如细胞上清,外泌体等建议采用Label free

 

3、样本个数

TMT目前一套可以做16样,大于16个样本则一般建议2套进行搭桥,去掉两个pool样,所以建议30个样本以内可选择TMT标记定量。

 

4、小tips

如果您的样本蛋白量足够,个体差异较大,希望选择TMT进行实验。从实验手段上来讲是可以做的,但是由于平行性不好可能会对结果产生一点不利影响。

 

三、Label free和DIA该如何选择?

 

1、实验上

两者检测样本实验前处理一样总体来讲,两种都属于非标记定量蛋白组学技术。

 

2、质谱采集模式

Label free和TMT都属于数据依赖型采集(DDA),即选择TOPN个母离子肽段进行二级碎裂检测;而DIA属于数据非依赖型的质谱采集方式,即在设置的扫描窗口内全部母离子都可以进入二级破碎(因此,可重现性高),能够获取更多的谱图信息,当然最终鉴定到的蛋白种类依赖于建库数据。

3、上机特点

TMT是混样分组分上机,但DIA和Label free均为单例样本上机,样本间不受影响,也不会受限于样本数量。综上:当样本个数较少时可选择Label free,大量样本时可选用DIA技术

 

四、总结表


最后小编为大家整理总结了定量蛋白组不同技术的对比图,大家记得收藏保存~

有兴趣采用蛋白质组学进行样本检测分析的老师,欢迎垂询服务热线:400-664-9912

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