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合作文章 | PRMT3通过增强LDHA的精氨酸甲基化促进糖酵解和HCC的生长

分类:
阿趣动态
发布时间:
2022/04/14 11:48
浏览量

文章标题:Protein arginine methyltransferase 3 promotes glycolysis and hepatocellular carcinoma growth by enhancing arginine methylation of lactate dehydrogenase A

发表期刊:Clin Transl Med

发表时间:2021年12月

影响因子:11.492

合作客户:华中科技大学同济医学院附属同济学院

百趣提供服务:LC-MS


研究背景

蛋白质精氨酸甲基化(Protein arginine methyltransferase)已在癌症中发挥关键作用。然而,蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)在肝癌(HCC)中的作用仍不清楚。在本文中使用转录组学,蛋白质组学,代谢组学等多组学并建立异种移植小鼠模型以研究PRMT3及其抑制剂SGC707对肿瘤生长的影响。我们的研究结果表明PRMT3在HCC中具有新的致癌作用,它有希望成为HCC的治疗靶点。


研究结果
1、PRMT3在HCC中显著上调并与预后不良相关

我们使用qRT-PCR分析了40对HCC和匹配的相邻非肿瘤组织中的PRMT3mRNA表达。PRMT3的mRNA表达水平在HCC组织中显著高于相邻非肿瘤组织(图1A)。同样,Western印迹分析和IHC分析也得到了相同的结果(图1B-D)。为了探讨PRMT3在HCC中的预后价值,我们通过IHC分析了一组人类HCC样本中PRMT3蛋白表达水平与患者临床特征之间的关系。Kaplan-Meier分析显示,PRMT3高表达患者的生存时间短于PRMT3低表达患者(图1E)。总的来说,这些发现表明PRMT3可以作为HCC进展的潜在预后生物标志物。

图1. PRMT3在肝细胞癌 HCC上调并与预后不良有关

2、PRMT3在体外和体内促进HCC细胞增殖和肿瘤生长

癌细胞生长在肿瘤进展过程中至关重要。为了阐明PRMT3在HCC生长中的作用,使用慢病毒感染多种稳定细胞株。实验结果表明,PRMT3下调可降低SNU398细胞增殖能力,而PRMT3上调可促进Huh7细胞增殖能力(图2A)。细胞计数及集落形成实验也得到了相同结果(图2B-C)。EdU染色检测结果显示,细胞增殖可能与PRMT3连接的精氨酸甲基化有关(图2D)。在裸鼠中建立皮下HCC异种移植模型,结果显示PRMT3敲除组小鼠的肿瘤比对照组的肿瘤生长更慢且更小,而PRMT3过表达则表现出相反的效果(图2E-G)。异种移植物的Ki-67染色显示PRMT3下调显着降低了增殖活性,而 PRMT3上调增加了增殖活性(图2H)。这些发现表明PRMT3在体外和体内促进了HCC中的细胞增殖和肿瘤生长。

图2. PRMT3促进肝细胞癌中的细胞增殖和肿瘤生长

3、PRMT3 促进 HCC 中的糖酵解

采用LC-MS/MS检测HCC细胞代谢产物,热图显示了对照组和PRMT3过表达细胞之间的主要差异代谢物(图3A),通过代谢途径分析,差异代谢物在正负离子模式下均在糖酵解或糖异生途径中富集(图3B)。PRMT3敲除导致葡萄糖消耗和乳酸生成显著减少,而PRMT3过表达则产生相反的效果(图3C-D),并分别测量了ECAR和OCR。结果表明敲除PRMT3可抑制糖酵解速率和糖酵解容量,而过表达PRMT3可导致ECAR的增加(图3E-F)。这些结果表明RMT3促进HCC中的糖酵解。

图3. PRMT3促进肝细胞癌 (HCC) 中的糖酵解

4、PRMT3与LDHA的精氨酸甲基化相互作用并促进其甲基化

为了阐明PRMT3在HCC中调节糖酵解的机制,我们通过IP/MS分析来鉴定其在HCC细胞中潜在的相互作用蛋白,鉴定出了5种潜在的糖酵解蛋白(图4A)。我们进行了Co-IP测定,进一步证实PRMT3与这些蛋白质在SNU398 细胞中的相互作用,然后专注于LDHA,一种糖酵解的关键酶。IF分析结果显示,PRMT3和LDHA主要共定位于细胞质中(图4B),Co-IP检测进一步证实了PRMT3和LDHA在SNU398和Huh7细胞中的相互作用(图4C-F)。我们还检测到ADMA信号的存在(图4D,F)。结果显示,PRMT3敲除的细胞降低了ADMA信号,而PRMT3过表达的细胞ADMA信号增加(图4G)。这些结果表明PRMT3与LDHA的精氨酸甲基化相互作用,并促进LDHA的甲基化。

图4. PRMT3与乳酸脱氢酶A的精氨酸甲基化相互作用并促进其甲基化

5、PRMT3的催化活性对PRMT3介导的HCC糖酵解和生长很重要

为了检查PRMT3催化活性是否会导致HCC糖酵解和生长发生改变,我们使用PRMT3-WT和催化失活突变体PRMT3-E338Q进行了进一步研究(图5A)。结果PRMT3-WT的过表达导致ADMA信号显着增加,而PRMT3-E338Q无法赋予ADMA修饰这种变化(图5B)。功能实验结果表明,与过表达WTPRMT3的细胞相比,过表达PRMT3催化失活突变体的细胞细胞增殖活性较弱,葡萄糖消耗和乳酸产生较少等(图5C-H)。这些发现表明PRMT3催化活性对 PRMT3-介导的HCC糖酵解和生长。

图5. PRMT3的催化活性对PRMT3介导的肝细胞癌(HCC)糖酵解和生长至关重要

6、LDHA 甲基化对 PRMT3 介导的 HCC 生长和糖酵解很重要

越来越多的研究表明精氨酸甲基化在酶活性调节中的重要性。在LDHA敲除的细胞中,当将R112K突变体转染到PRMT3过表达细胞和对照细胞中时,几乎检测不到ADMA信号(图6A)。序列比对证明了高度这种精氨酸残基在物种间的保守性暗示这种残基的甲基化可能具有生物学意义(图6B)。LDH活性测定的结果表明R112的突变显着减少PRMT3促进的LDH活性增加和指定细胞中的NAD+/NADH比率(图6C,D)。与WT载体相比,R112K突变体的葡萄糖消耗和乳酸产生也略有下降(图6E,F)。ECAR细胞结果也论证了这个结果(图6G)。CCK-8,集落形成和EdU染色测定结果表明R112突变减弱了HCC增殖(图6H-J)。这些数据表明LDHA 甲基化参与PRMT3介导HCC生长和糖酵解。

图6. LDHA甲基化对于PRMT3介导的HCC的生长和糖酵解具有重要作用

7、PRMT3抑制剂SGC707抑制HCC生长和糖酵解

为了进一步探索以确定PRMT3的药理学抑制是否可以逆转这种作用,选取SGC707在PRMT3过表达癌症中的治疗效果。发现PRMT3上调LDHA的ADMA甲基化,而SGC707逆转该作用处理(图7A)。同时,LDH活性和NAD+/NADH比率随着PRMT3过表达而增加,也因SGC707处理而部分减弱(图7B,C)。接下来,我们研究了SGC707处理是否对PRMT3过表达细胞中糖酵解的增强有影响。结果表明,以1μM的剂量添加SGC707阻止了PRMT3过表达诱导的糖酵解升高(图7D-F)。探索SGC707是否可以抑制PRMT3介导的体内HCC生长,结果显示SGC707可以(图7J-L)。Ki-67异种移植物的染色显示相同的结果(图7M)。这些结果表明PRMT3抑制剂SGC707可能是一种有前途的抑制HCC生长的方法。

图7. PRMT3抑制剂SGC707抑制HCC生长和糖酵解


结论

本研究证明了PRMT3在HCC中的致癌功能。过度表达PRMT3增强HCC细胞的糖酵解,从而促进细胞增殖和肿瘤生长。我们的研究为HCC中精氨酸甲基化修饰诱导的代谢失调提供了新的潜在分子视角,并为开发HCC治疗的新的潜在靶点提供了证据。

 

文献下载链接:

https://pan.baidu.com/s/1QWrGqo_QdwXEcOtavo39TA

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合作文章 | PRMT3通过增强LDHA的精氨酸甲基化促进糖酵解和HCC的生长