文章标题：Single-nephron proteomes connect morphology and function in proteinuric kidney disease
发表期刊：Kidney International
影响因子：19.6
在许多实质器官的疾病中，个体功能单元的异质性恶化决定了临床预后。然而，在这些单个亚基的水平上的分子表征仍然是一个技术挑战，需要加以解决，以便更好地理解病理机制。肾小球功能衰退通常被诊断为蛋白尿性肾病，蛋白尿性肾小球肾病是一种常见的综合性疾病，在不同程度上影响一部分肾小球及其引流管，目前尚无特效治疗方法。在这里，作者开发并应用了一种新的样本制备方法SP3(Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments)，SP3技术是一种基于超顺磁珠的方法，为快速高效地处理蛋白质和多肽样品提供了一个通用平台。
文章开发并采用基于SP3法的蛋白质组学来研究来自蛋白尿性肾病小鼠单独分离的肾单位节段的蛋白质组的异质性。在两种不同的硬化性肾小球疾病小鼠模型的单个肾小球中，发现了一个连贯的蛋白表达模块，包括细胞外基质蛋白沉积（反映肾小球硬化）、肾小球白蛋白（反映蛋白尿）和溶酶体蛋白LAMP1。这个模块与肾小球足细胞标志性蛋白的丢失有关，而基因消融LAMP1相关的溶酶体蛋白酶可以改善体内的肾小球损伤。此外，对遗传性硬化性和非硬化性蛋白尿症患者进行了单个肾小球的蛋白质组学分析发现，溶酶体蛋白的丰度增加，而突变基因产物的丰度降低。因此，蛋白质稳态改变（蛋白稳态）是蛋白尿肾病中一个保守的关键机制。
研究采用了新的一种样本制备方法SP3，可以大限度地减少蛋白质和肽段的损失，并且兼容大多数的裂解缓冲液（高达10%的十二烷基硫酸钠）。文章使用这种超灵敏的样本制备方法对单个野生型小鼠肾小球进行了蛋白质组学分析，并通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对其进行了定量。发现单个肾小球数据集包含了一些特定的蛋白质，包括足细胞蛋白（如nephrin、ACTN4、podocin和CD2AP）以及基底膜蛋白等。另外对微切割的肾小管各段进行了蛋白质组学分析，这是首次对这些结构进行蛋白质组学分析。在肾小管中，共鉴定出＞1500种蛋白，其丰度跨越4个数量级，可以根据已知的标志蛋白和全局蛋白质组水平来区分不同的肾小管段，包括近端小管（S1段）、远端小管和皮质集合管。
采用了新的蛋白质组学分析方法，可以解析出单个功能单位的蛋白质组，这种分析方法可以用来研究WT1基因半缺失的疾病模型。WT1足细胞特异性转录因子，控制足细胞特异性基因的表达。Wt1杂合（Wt1het）小鼠在14周时出现蛋白尿和部分硬化损伤，类似于局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)。研究人员选取了20个与足细胞功能相关的蛋白质，在Wt1het小鼠和野生型小鼠中进行PRM靶向验证。发现在Wt1het小鼠的单个肾小球中，白蛋白、胶原IV型和层粘连蛋白显著增加，这些发现与表型症状一致，表明肾小球中蛋白质的异常表达可能是导致病理变化的关键因素。除此之外，还观察到不同的肾小球之间存在较大的异质性。
随后对Wt1het小鼠和野生型小鼠的近端小管进行了系统性的分析。同样基于PRM靶向验证，选择了74个与近端小管生理功能相关的蛋白质，发现Wt1het小鼠的近端小管中，与氨基酸转运相关的蛋白SLC3A1、SLC13A3、SLC6A20a/b表达水平降低。此外，这些肾小管中还发现白蛋白和IV型胶原蛋白的丰度增加，反映了蛋白尿性肾病中近端小管的异质性和相关蛋白质的表达变化。总的数据表明单个功能单位的蛋白质组学，可以反映蛋白尿性肾病的病理机制。
LAMP1是溶酶体的结构蛋白，如果改变其表达或功能，可能会对溶酶体的正常功能产生负面影响，因此LAMP1可能不适合作为肾脏疾病的关键治疗靶点。为了寻找更好的治疗靶点，研究者们决定关注其他更容易被药物靶向的溶酶体成分。他们特别关注了组织蛋白酶L和其他组织蛋白酶，这些酶在足细胞中表达，并可能在足细胞中发挥功能。因为组织蛋白酶可以在溶酶体之外发挥作用，所以研究者们研究了LAMP1丰度与组织蛋白酶丰度之间的关系，通过PRM靶向方法检测四种蛋白质（组织蛋白酶B、L、Z和LAMP1）的表达水平。发现在Wt1het小鼠的单个肾小球中，组织蛋白酶 B、L和Z均增加，且组织蛋白酶B和L均与LAMP1丰度显著相关。在阿霉素诱导的小鼠模型中，也发现组织蛋白酶B和Z增加，且都与LAMP1的丰度显著相关。为了更系统地测试LAMP1相关的组织蛋白酶是否可能导致肾小球损伤，研究者们进行了基因敲除实验，对编码组织蛋白酶B、L和Z的基因进行敲除。发现在正常或基线条件下，基因敲除小鼠的组织蛋白酶B、L和Z的表达水平较低，没有显示出蛋白尿的症状。然而，这三种敲除品系，尤其是组织蛋白酶B敲除品系，在肾小球损伤或足细胞损伤后表现出更强的抵抗性和更快的恢复(图3)。这些发现表明，LAMP1相关的组织蛋白酶B可能是肾小球损伤的重要因果介质。
图3 单个肾小球分析揭示肾小球疾病中的疾病驱动蛋白
在研究肾小球疾病的过程中，研究人员发现在两类小鼠肾病模型中，LAMP1的增加是其共同特征，之后进一步探究LAMP1及其模块（组织蛋白酶、白蛋白、细胞外基质蛋白）在人类蛋白尿性肾脏疾病中的作用。通过对比肾病综合征患者和肿瘤肾切除患者的单个肾小球中的蛋白质组，以及分析患有先天性肾病综合征患者的肾小球，发现LAMP1和这个模块中的其他蛋白质在多种肾小球疾病中表达增加或减少（图4）。这些发现可能有助于对肾小球疾病的进一步理解和研究，为防治肾小球疾病提供新的思路。
图4 应用超灵敏蛋白组学确定致病机制
本研究中，作者采用了一种新的前处理方法：基于磁珠的SP3结合质谱的方法来研究来自蛋白尿性肾病小鼠的单个肾小球和肾小管段的蛋白质组的异质性。在两种不同的硬化性肾小球疾病小鼠模型的单个肾小球中，发现了一个连贯的蛋白表达模块，包括细胞外基质蛋白沉积(反映肾小球硬化)、肾小球白蛋白(反映蛋白尿)和一种溶酶体蛋白LAMP1。这个模块与足细胞标记蛋白的丢失有关，而基因消融LAMP1相关的溶酶体蛋白酶可以改善体内的肾小球损伤。此外，对遗传性硬化性和非硬化性蛋白尿症患者的单个肾小球进行的蛋白质组学分析显示，溶酶体蛋白的丰度增加，而突变基因产物的丰度降低。因此，蛋白稳态改变(蛋白稳态)是蛋白尿性肾病的一个保守的关键机制。此外，该技术可以捕捉肾脏和其他组织疾病在亚活组织范围内的个体内变异性。
