文章标题：Spatiotemporal transcriptome and metabolome landscapes of cotton somatic embryos

发表期刊：nature communications

影响因子：15.7

研究背景

棉花是世界上最重要的商品作物之一，但棉花的遗传转化依赖于复杂、耗时且基因型依赖的体细胞胚再生(Somatic embryogenesis, SE)过程。SE是与植物组织培养再生相关的发育过程，是作物育种和改良的有用技术。然而，棉花的SE过程复杂且难以捉摸，因为缺乏关于SE过程中基因表达模式重编程的精确细胞水平信息。

近期，中国农业科学院棉花研究所葛晓阳研究团队及河南大学生命科学学院孙旭武研究团队在nature communications上发表了题为“Spatiotemporal transcriptome and metabolome landscapes of cotton somatic embryos”的研究论文。该研究通过整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)、空间转录组(ST)和空间代谢组(SM)技术，研究了棉花SE过程中关键基因的空间和单细胞表达谱以及关键代谢物的代谢模式。功能表征了两个代表性标记基因AATP1和DOX2在调控棉花体细胞胚发育中的作用。

研究结果

1、棉花的时空转录组分析

该研究首先利用ST全面评估了棉花体细胞胚胎发育过程中基因的空间表达模式（图1a-c），最终得到每个切片801-1217个高质量斑点，平均每个斑点有6287-8001个表达基因。使用均匀流形近似和投影(UMAP)将数据划分为13个细胞簇，然后将其映射回其在组织切片中的原始位置（图1d-e），还构建了每个簇中最高表达基因的点图（图1f）。这些高度表达的簇特异性基因可能有助于特定细胞簇的发育。在13个聚类中鉴定差异表达基因(DEG)，并对DEG进行GO富集分析。与“胚胎后发育调控”相关的基因在“子叶细胞”（第9组）中高度表达，而与“对其他生物的防御反应”相关的基因在“皮质细胞-11”（第11组）中高度表达。这些结果表明DEG可能在SE的不同阶段发挥特定的生理功能。

图1.棉花体细胞胚胎发生三个阶段的空间转录分析

2、体细胞胚胎初始发育调控基因的空间表达

愈伤组织细胞的初始诱导和胚性细胞的形成是棉花体细胞胚发育的最关键阶段。该研究对棉花下胚轴诱导的愈伤组织进行了ST分析（图2），共获得了六个细胞簇（图2a）。维管组织标记基因ANT和维管细胞形成相关基因WOX13的同源物都在集群1中表达，表明集群1包含来自外植体和愈伤组织的维管组织细胞。表皮细胞标记基因乙烯响应元件结合因子4(ERF4)在“外植体细胞层”（集群2）中表达。胚根根尖分生组织标记基因如生长素抗性2(LAX2)的同源物在“愈伤组织细胞中层”（第4组）中表达。WOX4的同源物在“愈伤组织细胞内层”（第5组）中表达。与每个细胞集群相关的标记基因的表达如图2b-c。

图2.非胚性愈伤组织的空间转录分析

3、棉花体细胞胚多发育阶段的基因表达模式

为了进一步研究棉花体细胞胚中基因表达与组织发育的关系，将三个发育阶段的所有样本分成9个切片，进行Pearson相关性分析。之后分析了9个切片内不同细胞簇中DEG的GO富集和空间表达。

4、棉花体细胞胚形成层发育的调控基因

干细胞分裂和分化的空间格局是植物生长发育的基础。此外，胚性细胞的分化标志着胚胎发育的开始。在胚胎发育和成熟的差异开始于胚胎基部的芽和根分生组织以及形成层。文章发现许多众所周知的转录因子(TF)编码基因在形成层簇中高度表达。其中REV、SHR、MP/ARF5和ATHB-15与形成层分化和维管发育有关。B-HD-ZIP基因家族的几个TF，如HAT、ATHB-13、ATHB-20和ATHB-6也在形成层簇中被鉴定出来。

5、体胚发育过程中基因表达的ScRNA-seq分析

为了评估单个细胞的转录异质性，对从ST的样品中分离的原生质体进行了scRNA-seq分析。经过质控和筛选，在球形、鱼雷和子叶胚胎中分别鉴定出8842、9031和9037个单细胞转录本，平均每个细胞分别有2339、1992和2146个基因。UMAP分析后共鉴定出11个细胞簇（图3a），并构建了与每个细胞簇相关的几个高表达标记基因的表达点图（图3b）。相关性分析显示scRNA-seq和ST数据之间存在强相关性。每种细胞类型都用ST识别的标记基因进行注释，随后在每个簇中识别DEG。例如，在簇2中高度表达的Gh_A05G087300是丝裂原活化蛋白激酶3(MPK3)的同源物，MPK3在拟南芥的表皮细胞和胚胎发育中起着重要作用。因此，簇2被归类为“表皮细胞_2”。生长素22(AUX22)和细胞色素P450 87A3(CYP87A3)的同源物分别在“地面组织细胞_3”（簇3）和“叶肉细胞”（簇5）中高度表达（图3c）。

图3.棉花体细胞胚发育的单细胞分析

接下来，利用拟时序分析来构建细胞分化的发育轨迹（图4a）。不同的细胞簇在沿拟时序轨迹的不同分支位置明显（图4b）。之后分析每个单细胞集群在不同拟时序阶段的基因表达（图4c），并将数据分为三类。并成功鉴定出33个在受精当日特异性表达的标志基因，诸如木葡聚糖内转糖基化酶和氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACC)等（图4）。进一步的GO富集分析揭示，与受精前一天相比，受精当天的上调差异表达蛋白在蛋白质翻译及核糖体小亚基组装功能方面呈现出显著富集。此外，研究还揭示了一系列可能参与调控纤维细胞早期发育过程的基因。

图4.对受精前1.5天到受精后1天的所有棉花胚珠样品进行拟时序分析

6、体细胞胚胎发育基因表达图谱的构建

胚胎发生的初始开始对于将非胚性愈伤组织细胞转化为胚性细胞至关重要。根据ST数据，几个高度表达的基因与“非胚性愈伤组织”（第13组）、“前胚性细胞”（第6组）和“球形胚胎cell_10”（第10组）相关。原位杂交(ISH)揭示了ABC转运蛋白G家族成员11(ABCG11)主要表达在球形和鱼雷胚胎的内皮层中（图5b-d）。ABCG11在拟南芥中编码表皮脂质转运蛋白。胚胎表皮的建立和维持对于胚胎的正常发育至关重要。在高等植物中，芽器官的表皮起源于胚胎表皮，它保护胚胎免受生物和非生物压。使用ST数据集，分析了在“表皮细胞”（集群3）、“皮质细胞_1”（集群1）和“皮质细胞l_12”（集群12）中表达的关键基因，以确定可能调节皮质和表皮细胞发育的基因。富含半胱氨酸的受体样蛋白激酶29(CRK29)属于编码富含半胱氨酸的蛋白激酶的受体样激酶。在棉花中，CRK29在“表皮细胞”（集群3）以及早期球形和鱼雷胚胎的表皮中表达。ISH发现Gh_A13G249900是AHP3的同系物，在球形胚胎的皮层中表达，并分布在鱼雷和子叶胚胎的皮层中。ISH发现LBD12主要在鱼雷胚胎的皮层中表达，这进一步验证了细胞簇分类的可靠性。

图5.棉花中调节SE的特定基因的时空分析

7、AATP1和DOX2负向调节棉花体细胞胚发育

利用ST数据集发现AAA-atpase1(AATP1)在“球状胚_10”（聚类10）中表达，而DOX2在“前胚性细胞”（聚类6）中表达。这两个聚类都是与棉花体细胞胚胎再生相关的关键细胞类型。由于AATP1和DOX2在棉花SE的早期阶段均被发现高度表达，文章利用三个过表达(OE)和三个CRISPR/Cas基因编辑系来评估每个基因的功能（图6）。与野生型(WT)相比，OE系中AATP1和DOX2的表达水平显著增加（图6a-b）。AATP1-CAS和DOX2-CAS转基因愈伤组织(Cs)比WT Cs增殖更快，在诱导的前30天结束时表现出更大的体积。相比之下，AATP1-OE和DOX2-OE Cs的增殖率和体积低于WT对照（图6c-d）。到90天结束时，AATP1-CAS和DOX2-CAS Cs都很易碎，很容易被识别为胚性愈伤组织(EC)。相比之下，AATP1-OE和DOX2-OE Cs在愈伤组织诱导的初始阶段比WT对照和CAS Cs增殖更慢，它们的体积也更低。AATP1-CAS和DOX2-CAS Cs的分化率在90天结束时均增加（图6e）。然而，与WT对照相比，OE Cs的体积或重量没有明显差异。愈伤组织诱导90天后，AATP1-OE和DOX2-OE Cs变硬，没有显示出EC发育的迹象（图6c）。AATP1-CAS和DOX2-CAS Cs都表现出比WT对照更高的诱导和分化率（图6e）。在第30天，AATP1-CAS和DOX2-CAS Cs的细胞呈原始圆形或椭圆形，表明向EC细胞的转化。相反，OE Cs的细胞出现拉长，表明这些细胞处于非胚胎状态。总之，这些结果表明AATP1和DOX2负调控愈伤组织起始和EC形成。

图6.棉花愈伤组织发育的代表性标记基因的功能分析

8、棉花体细胞胚发育过程中代谢物的MSI分析

该研究使用气流辅助解吸电喷雾电离质谱成像(AFADESI-MSI)技术，对棉花体细胞胚发育过程中的动态代谢变化进行了研究（图7）。代谢结果显示，大多数代谢物表现出高度的空间异质性，比如：脂肪酸、磷脂酸和磷脂酰胆碱在棉花胚珠区域特异性高表达，而磷脂酰肌醇和碳水化合物在腔室区域特异性表达。另外，通过对空间代谢物的差异分析发现，从受精前1.5天到受精后5天，胚珠中二十碳二烯酸、亚油酸、PE-44:10、精胺、胆碱的表达丰度逐渐降低，表明这些代谢物可能与纤维的起始发育密切相关。相反，胚珠中α-亚麻酸、组氨酸、油酸和PA(34:1)表达丰度逐渐增加，说明这些代谢物可能与纤维的早期伸长密切相关。通过对空间代谢组学数据的聚类、表达模式分析以及纤维发育早期的时空解剖学变化结果，发现纤维细胞在受精当天从胚珠外皮细胞开始，然后在受精三天后长度显著增加，表明受精3天是纤维伸长的关键阶段。为了进一步确定纤维起始发育阶段的关键代谢物，作者比较了受精前1.5天与受精当天的空间代谢谱，结果发现受精当天，胚珠中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸盐代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和组氨酸代谢等通路被激活，亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢通路中物质显著下调。同时将受精后3天与受精前1.5天空间代谢谱作比较，结果发现磷酸戊糖途径，角质、木脂和蜡的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，淀粉和蔗糖代谢，不饱和脂肪酸的生物合成等通路被激活。精氨酸生物合成，亚油酸代谢，泛酸和CoA生物合成，β-丙氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，谷胱甘肽代谢等通路上的代谢物显著下调。

图7.棉花胚珠的代谢物在空间上的异质性

9、转录组和代谢组学数据综合分析

通过将空间转录组数据与空间代谢组学数据的整合分析发现，纤维发育早期LCAT4或PLA2-ALPHA催化磷脂酰胆碱代谢为α-亚麻酸，并在胚珠中高度表达。α-亚麻酸不仅可以被DOX2催化至2(R)-HPOT（图8a），还可被LOX3.1.3至13(S)-HPOT催化。然后，HPL催化13(S)-HPOT代谢为创伤酸。在这个代谢途径中，α-亚麻酸可以通过一系列酶的催化转化为茉莉酸。通过对α-亚麻酸相关基因表达水平的分析，发现这些基因受精后3天和5天细胞核和纤维细胞中高度表达（图8b）。这些结果与α-亚麻酸在3-DPA和5-DPA胚珠中的高积累一致，进一步说明α-亚麻酸作为标志性代谢物在早期纤维伸长中起重要作用。通过对α-酮戊二酸、L-天冬氨酸、脂肪酸代谢产物、胺类代谢产物、生长素以及类似油菜素内酯等物质以及相关基因的分析，发现这些物质在棉花纤维早期发育过程中也发挥着重要作用。

图8.α-亚麻酸代谢组学分析

研究结论

本研究基于合理的多时期采样策略以及空间转录组学、空间代谢组学、单细胞转录组学技术的组合应用，证明了棉花纤维起始和伸长过程中转录组和代谢组的时空图谱系统阐明了棉花SE过程中基因和代谢物的时空动态变化。鉴定了关键调控因子，并构建了易于搜索的网络资源数据库，为棉花遗传转化和育种提供了重要参考。此外，功能分析揭示了AATP1和DOX2基因在棉花SE过程中的负调控作用，为进一步研究棉花SE的分子机制提供了新的视角。