英文标题：ACSL4-Mediated Membrane Phospholipid Remodeling Induces Integrin β1 Activation to Facilitate Triple-Negative Breast Cancer Metastasis

中文标题：ACSL4介导的膜磷脂重塑诱导整合素β1激活以促进三阴性乳腺癌转移

发表期刊：Cancer Research

影响因子：16.6

客户单位：重庆医科大学

百趣提供服务：定量脂质组学、经典脂质组学

研究背景

乳腺癌是女性常见癌症，具有显著异质性。三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer, TNBC)占所有乳腺癌病例的12%~17%，缺乏雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)、黄体酮受体(Progesterone Receptor, PR)和HER2，预后较差，复发和转移率高。脂质代谢异常可促进肿瘤转移，但其在TNBC中的具体机制尚不清楚。本研究发现，转移性TNBC细胞中ACSL4异常上调，与不良预后和转移相关。ACSL4通过催化PUFA生成PUFA-CoA并将其酯化为磷脂，增加磷脂不饱和度，改变膜生物物理性质，促进脂筏中整合素β1和CD47的富集与相互作用，激活整合素β1/FAK信号通路，促进TNBC转移。此外，ACSL4抑制剂PRGL493联合紫杉醇和顺铂可显著抑制TNBC生长和转移，为TNBC治疗提供了新策略。

ACSL4调控机制和靶向治疗示意图

研究结果

2.1 在转移性TNBC肿瘤中，磷脂不饱和度升高

为了确定转移性TNBC肿瘤的脂质谱，研究人员采用 LC/MS-MS脂质组学分析，检测了NCG小鼠肝脏中四对原发性和转移性肿瘤组织中的脂质代谢物变化。共鉴定出785种脂质代谢物，其中71种在转移瘤中显著增加，70种显著减少。磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine, PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine, PE)是转移瘤中变化最显著的主要脂质（图1A-C）。进一步分析发现，与原发肿瘤相比，转移性肿瘤中多不饱和磷脂(PUFA-containing Phospholipids, PUFA-PL)的丰度显著升高，而饱和脂肪酸磷脂(saturated fatty acid-containing phospholipids, SFA-PL)和单不饱和脂肪酸磷脂(monounsaturated fatty acid-containing phospholipids, MUFA-PL)的丰度显著降低。转移性肿瘤倾向于产生更多含有4个或更多不饱和键的总磷脂、PE和PC，且在sn-2位置的多不饱和脂肪酰基链（18–22碳）更丰富（图1D-H）。这些结果表明，含有长链多不饱和脂肪酸(long-chain PUFAs, LC-PUFA)的磷脂是转移性TNBC的代谢特征。

图1. 在转移性TNBC肿瘤中，磷脂不饱和度升高

2.2 ACSL4升高与TNBC预后不良相关，并有助于转移

TNBC相较于ER阳性乳腺癌(ER+BC)具有更高的转移倾向，且其肿瘤细胞中富含多不饱和磷脂(PL-PUFAs)，而ER+BC则富含单不饱和磷脂(PL-MUFAs)。这提示TNBC存在独特的磷脂重塑现象，可能促进肿瘤转移。为了探索TNBC细胞中调节 PUFA-磷脂重塑的关键酶，作者通过分析数据集 METABRIC，发现ACSL4等基因在TNBC中与磷脂重塑相关，且ACSL4在TNBC细胞中表达上调。研究人员通过免疫组化染色评估了30例TNBC患者配对肿瘤和正常组织中ACSL4蛋白水平，发现TNBC组织中ACSL4蛋白染色更强（图2A-B）。在包含95例腔内乳腺癌、34例HER2阳性乳腺癌和31例TNBC患者的组织微阵列芯片(Tissue Microarrays, TMA)中，TNBC的ACSL4 IHC评分高于其他亚型（图2C-D）。Kaplan-Meier生存分析显示，ACSL4高水平与乳腺癌患者的N期和较差总生存期显著相关（图2E-F）。ACSL4表达与远处转移相关，转移性TNBC患者的原发肿瘤中ACSL4 mRNA水平更高（图2G-H）。ACSL4表达与远端无转移生存率呈负相关。在 NCG小鼠模型中，与原发肿瘤相比，肺和肝转移瘤中ACSL4水平更高。ACSL4敲低损害了TNBC细胞的迁移和侵袭能力，而异位ACSL4则恢复了这些能力。在NCG小鼠模型中，MDA-MB-231中ACSL4的缺失显著诱导CTC凋亡，降低肺和肝脏的转移负担，并减少转移灶中Ki-67阳性细胞（图2J-O）。这些结果表明ACSL4是TNBC转移的关键因素，可作为恶性TNBC的生物标志物。

图2. ACSL4增强与TNBC预后不良相关，并促进转移

2.3 ACSL4促进TNBC细胞中PUFA-PLs的产生

为了揭示ACSL4在TNBC细胞中对PUFA-PLs生成的调控机制，研究人员通过实验发现ACSL4在TNBC细胞中通过促进多不饱和脂肪酰基磷脂(PUFA-PLs)的生成来调节细胞膜磷脂组成（图3A），并影响TNBC细胞的转移能力。研究发现，ACSL4缺失导致PUFA-CoA减少，SFA-CoA和MUFA-CoA增加，同时PUFA-PLs（如PUFA-PC和PUFA-PE）也减少。ACSL4敲低的细胞中，饱和程度为4的磷脂（包括PE和PC）百分比降低，而饱和程度为1的磷脂百分比增加。此外，ACSL4敲除显著降低了特定LC-PUFA-PLs（如PE(18:0/20:4)和PE(16:0/20:4)）的水平（图3C-D）。这些变化导致细胞膜流动性降低，表明ACSL4对TNBC细胞膜磷脂组成和生物学特性有显著影响（图3E-G）。另外，研究还证明，ACSL4介导的PUFA-PLs变化影响TNBC转移。实验中，ACSL4敲低的肿瘤细胞分别用SFA-PE、MUFA-PE和PUFA-PL处理后，外源性PAPE脂质体显著恢复了细胞的侵袭能力和失巢凋亡抵抗，并增加了转移负荷及Ki-67阳性细胞数量（图3H-K）。PAPE未显著降解为AA或LPA，且PLA2抑制剂giripladib不影响PAPE处理后的细胞侵袭和失巢凋亡抗性，表明PAPE本身而非其代谢物在ACSL4沉默的乳腺癌细胞中起代偿作用。ACSL4通过调节膜磷脂组成和不饱和度，促进乳腺癌细胞的侵袭、抗凋亡和转移性生长。

图3. ACSL4促进TNBC细胞PUFA-PL的产生

2.4 磷脂重塑促进了ITGB1和CD47在脂筏中的定位和相互作用

为了探究ACSL4介导的细胞转移机制，研究人员分析了ACSL4相关的信号网络，对乳腺癌肿瘤中的基因表达谱（来自TCGA数据库）进行分析发现ACSL4表达与肿瘤转移相关的信号通路存在相关性，例如细胞外基质-受体相互作用和黏着斑形成。研究表明，膜磷脂饱和度会影响脂筏中受体的定位和激活，而ACSL4介导的磷脂不饱和可能激活脂筏中的促转移信号分子，进而促进转移相关信号通路。实验显示，ACSL4敲除后，脂筏中的CD47和ITGB1蛋白水平显著降低，而外源性PAPE脂质体处理可恢复其水平（图4A-E）。此外，ACSL4敲除削弱了CD47与ITGB1的相互作用，而PAPE脂质体处理可部分挽救这种相互作用，但脂筏抑制剂MβCD可阻断该效应（图4G）。这些结果表明，ACSL4介导的磷脂重塑通过调节CD47和ITGB1在脂筏中的定位和相互作用，促进了TNBC细胞的转移能力。

图4. 磷脂重塑促进了ITGB1和CD47在脂筏中的定位和相互作用

2.5 CD47对于不饱和磷脂介导的整合素β1/FAK信号的激活至关重要

为了探讨ACSL4介导的膜磷脂重塑对整合素β1(ITGB1)活性及其下游FAK信号通路的影响。通过结果表明，ACSL4缺失减少了活化整合素β1(Act-ITGB1)在脂筏中的定位和蛋白水平，但外源性PAPE脂质体处理可恢复其水平（图5A-D）。PAPE处理还增强了pFAK水平，激活了FAK信号通路，促进了细胞侵袭和抗失巢凋亡，而这些效应可被CAV1沉默或FAK抑制剂defactinib阻断。此外，CD47是整合素β1/FAK信号激活和细胞侵袭的关键因子，ACSL4缺失降低了Act-ITGB1与CD47的共定位，而PAPE处理可恢复这种共定位，但CD47沉默会削弱PAPE的恢复作用（图5E-J）。体内实验进一步证实，高表达ACSL4的TNBC肿瘤中，Act-ITGB1在脂筏中的定位增强，且FAK信号激活显著增加。这些结果表明，ACSL4通过膜磷脂重塑影响整合素β1的脂筏定位和活性，进而激活FAK信号通路，促进TNBC细胞侵袭，而CD47在这一过程中发挥重要作用。

为了证明体内ACSL4表达与ITGB1/FAK信号激活之间的关联，研究人员分析了TNBC肿瘤组织中ACSL4、ITGB1和pFAK蛋白水平。高表达ACSL4的肿瘤增强了Act-ITGB1在脂筏中的表达和定位（图6A-B），这与FAK信号激活增加显著相关（图6C-D）。

图5. CD47对于不饱和磷脂介导的整合素β1/FAK信号的激活至关重要

图6. 在TNBC样本中，ACSL4表达水平与ITGB1和FAK激活状态呈正相关

2.6 靶向ACSL4增加TNBC对化疗的敏感性，抑制TNBC的生长和转移

为了评估靶向ACSL4在TNBC治疗中的潜在价值。实验结果显示，ACSL4低表达的TNBC患者对紫杉醇(PAC)治疗更敏感，而高表达者则表现为耐药（图 7A-C）。在40例接受紫杉醇治疗的患者中，耐药肿瘤的ACSL4蛋白水平显著更高。进一步的体内实验表明，ACSL4抑制剂PRGL493联合紫杉醇和顺铂(Cisp)治疗显著抑制了TNBC小鼠模型的肿瘤生长和转移，效果优于单独或两药联合治疗（图7D-J）。此外，PRGL493单独处理可缩小对照TNBC细胞的肿瘤体积，但对ACSL4缺陷细胞无影响，并且治疗未引起小鼠体重的明显变化。机制上，PRGL493处理降低了肿瘤细胞中含LC-PUFAs的磷脂水平。这些结果表明，靶向ACSL4可增强TNBC对化疗的敏感性。

图7. 靶向ACSL4可增加TNBC对化疗的敏感性并抑制其生长和转移

研究结论

TNBC患者预后差，因其侵袭性和高转移性，且缺乏有效治疗靶点。研究发现，转移性TNBC细胞中磷脂不饱和度显著增加，ACSL4（长链酰基辅酶A合成酶4）上调，驱动PUFA掺入磷脂，导致膜磷脂重塑。ACSL4介导的磷脂重塑促进脂筏中整合素β1和CD47的富集及相互作用，激活整合素β1/FAK信号通路，促进TNBC转移（图7）。靶向ACSL4可增强TNBC对化疗的敏感性，为TNBC治疗提供新策略。脂筏在ACSL4介导的信号传导中起关键作用，促进整合素β1与CD47的相互作用和信号激活。CD47对整合素β1功能至关重要，其缺失会削弱ACSL4介导的FAK磷酸化和TNBC的侵袭及抗失巢凋亡能力。此外，联合使用ACSL4抑制剂PRGL493、紫杉醇和顺铂可显著抑制TNBC生长和转移，表明靶向ACSL4可增强化疗效果。综上所述，ACSL4介导的磷脂重塑是TNBC转移的关键机制，靶向ACSL4有望成为TNBC治疗的新靶点，改善患者预后。

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