英文标题：Diosgenin in Dioscorea spongiosa Suppresses Glycolysis-Driven Angiogenesis as a ROCK1 Inhibitor
中文标题：萆薢中的diosgenin通过抑制ROCK1抑制糖酵解驱动的血管生成
发表期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
影响因子：6.2
客户单位：皖南医学院
百趣提供服务：DIA中药入血组、新一代代谢组学NGM 2 Pro、AQ能量代谢
研究背景
类风湿关节炎(RA)是一种以慢性滑膜炎和血管异常增生为特征的自身免疫性疾病。血管内皮细胞(HUVECs)的代谢重编程和异常活化会导致血管生成，进而加剧滑膜炎症与组织破坏。已有研究表明，活化的HUVECs即使在富氧环境中仍主要依赖糖酵解供能。因此，干预HUVECs的活化及其代谢状态成为RA的潜在治疗策略。课题组前期研究发现，清络饮(QLY)具有良好的抗血管生成作用，而其中关键中药成分萆薢(BX)可能通过调控代谢通路发挥作用。但目前BX是否以及如何干预RA中HUVECs的活化过程还尚不明晰。因此，本研究基于BX提取物，结合体内外模型验证、代谢组分析、成分筛选与靶点识别等方法，探讨BX对HUVECs活化及血管生成的调控机制，为RA治疗提供新的天然药物来源。
研究结果
1、BX治疗显著调节了佐剂性关节炎(AIA)大鼠的代谢状态
BX治疗AIA大鼠28天后，显著降低关节炎评分并减缓体重下降（图1A-B），同时抑制炎症因子(IL-1β、IL-17A、iNOS)表达，改善氧化应激指标MDA、SOD、GSH（图1C-D）。BX还缓解了关节畸形和滑膜增生（图1E-F），降低AKP水平（图1G）。BX恢复了AIA引起的WAT体积降低（图1H-I）、抑制血糖升高（图1J），并降低关节内T-CHO和丙酮酸水平（图1K），表明其具有调控糖酵解能力。
图1 BX治疗改善AIA大鼠的代谢和免疫异常
代谢组学分析显示，正常、AIA组与BX组代谢谱存在差异，其中代谢调控网络揭示VEGF和脂肪因子信号通路在RA代谢中起重要作用（图2A-C）。共鉴定到一批脂类相关的差异代谢物，其中第7类主要为脂肪酸，它在BX处理后明显恢复（图2D-F）。KEGG富集分析表明，BX可逆转AIA模型中脂肪酸生物合成受抑的状态（图2G），表明其能够调控脂质代谢，通过作用于WAT间接影响血管生成。
图2 QLY治疗恢复AIA大鼠关节的代谢谱异常
2、BX通过代谢重编程抑制AIA诱导的血管生成
BX治疗恢复AIA大鼠脂肪细胞形态并减少WAT内血管生成（图3A）。BX恢复了AIA诱导的T-CHO、DAG、油酸和血糖异常（图3B），并下调脂肪酸氧化相关基因（图3C）。BX显著抑制脂肪因子visfatin，同时下调WAT中visfatin、HIF-1α和VEGF的表达（图3D-E）。免疫组化结果显示，BX可降低AIA模型中visfatin与CD31阳性血管的表达（图3F），表明BX通过调节脂肪组织代谢与脂肪因子分泌，抑制血管生成。
图3 BX通过代谢重编程抑制了AIA诱导的血管生成
在AIA模型中，滑膜及Matrigel组织中新生血管显著增多，BX治疗后血管减少（图4A-C）。BX抑制了VEGF和PDGF分泌，并显著下调关节中PKM表达（图4B-D）。在HUVECs中，BX可抑制糖酵解代谢，提高TCA中间产物（图4E-H）。综上所述，BX通过改善免疫微环境和抑制糖酵解，干预血管生成过程（图4I）。
图4 糖酵解抑制参与了BX对AIA大鼠的抗血管生成作用
3、糖酵解抑制介导了BX在体外的抗血管生成作用
BX对HUVECs活性的抑制依赖于浓度，50-800 μg/mL范围内有效（图5A）。BX处理后可降低葡萄糖代谢产物及MDH活性（图5B-C），同时抑制HUVECs迁移、成管与划痕修复能力（图5D）。BX在50 μg/mL时仍能抑制对被VEGF活化HUVECs的葡萄糖代谢产物、MDH活性和血管生成（图E-G）。此外，BX还下调糖酵解相关基因及信号蛋白表达（图5H-I），表明其通过糖酵解通路抑制HUVECs活化。
图5 BX通过抑制糖酵解途径抑制了HUVECs的活化
4、diosgenin是BX提取物中的关键的抗血管生成成分
BX提取物按极性分为30个组分，筛选发现第14组分抗糖酵解作用最显著（图6A-C）。利用DIA中药入血组分析，发现第14与29组分中共存在19种代谢物，其中diosgenin在两个组分中均丰度较高，且在BX原药中含量较高（图6D-F）。而dioscin虽丰度高，但血清中浓度低，这是由于其在体内可被水解为diosgenin（图6G）。综合结果表明，diosgenin是BX发挥药效的关键活性成分。
图6 diosgenin是BX提取物中对HUVECs具有抑制作用的关键成分
与methyl vanillate（两个组分共存的成分）、hesperetin（BX的提取物）比较，diosgenin显著抑制HUVECs增殖且不损伤细胞，并提高培养基中丙酮酸残留（图7A-B）。其有效下调糖酵解关键基因和PFK和PKM的酶活性，减少乳酸和丙酮酸生成（图7C-D）。diosgenin抑制VEGF诱导的成管及VECs活化相关蛋白和糖酵解基因的表达（图E-G）。表明BX能够通过多通路抑制HUVECs活化。
图7 diosgenin同时抑制HUVECs的活化与糖酵解过程
5、diosgenin通过靶向结合ROCK1抑制HUVECs的活化
通过生物素标记diosgenin进行pull-down实验，确认ROCK1为其特异结合蛋白（图8A-C）。分子对接及动力学模拟表明diosgenin可稳定嵌入ROCK1催化结构域且不影响构象（图8D-E）。diosgenin可与biotin-diosgenin竞争结合ROCK1（图8F），并保护其免受热与酶降解（图8G-H），同时显著抑制ROCK1磷酸化（图8I），其结合关系经WB&IF试验进一步验证（图8J）。
图8 diosgenin靶向结合HUVECs中的ROCK1
diosgenin与ROCK1抑制剂GSK429286A作用一致，均可抑制VEGF诱导的血管生成及相关基因表达（图9A-B）。在敲除ROCK1下，VEGF不再诱导血管生成，且diosgenin失去抑制作用（图9C-E），乳酸与MDH水平亦未改变（图9F）。此外，ROCK1激动剂arachidonate可部分拮抗diosgenin抑制效应（图9G-H）。综上，diosgenin依赖ROCK1实现其抗血管生成功能。
图9 diosgenin依赖ROCK1信号通路抑制细胞血管生成
研究结论
本研究揭示了中药萆薢(BX)在调控脂质代谢、糖酵解及抑制血管生成方面的作用机制。通过代谢组学筛选与机制验证，确定了diosgenin是BX中治疗RA的关键活性成分。diosgenin通过靶向结合ROCK1蛋白，抑制其磷酸化，从而阻断ROCK1介导的HUVECs过程，包括迁移、成管与糖酵解功能。
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