研究背景
肿瘤相关碳水化合物抗原(Tumor-Associated Carbohydrate Antigens, TACAs)的异常糖基化是癌症的重要标志，其中Tn抗原(CD175)作为黏蛋白O-聚糖前体单糖(α-GalNAc)，在结肠、乳腺、胰腺等多种癌症中高表达，并与肿瘤侵袭性、转移及免疫抑制密切相关，是潜在的诊断标志物及治疗靶点。然而，传统检测方法（如凝集HPA、SBA、VVA及抗体）存在特异性差（凝集素可结合血型A等含末端GalNAc的聚糖）和灵敏度低（抗体需识别特定Tn-肽表位且依赖多价结合）的缺陷，而现有化学酶法因ST6GalNAc1的多底物特性难以单独区分Tn抗原，亟需高效检测技术。本研究开发的一步酶促标记策略，通过设计荧光/可切割生物素标记的UDP-Gal衍生物，利用T-合成酶底物特异性实现Tn抗原的高效标记与精准定位，为解决上述问题提供了创新方案。
研究结果
1、核心技术策略：一步酶促标记系统的设计
（1）探针设计与酶促标记原理
研究团队基于尿苷-5′-二磷酸-α-D-半乳糖(UDP-Gal)衍生物，合成两种功能性探针：带荧光基团Cy3 的探针II和含可切割二硫键生物素的探针III。利用人T-合成酶(C1GalT1)对Tn抗原的底物特异性，通过一步酶促反应直接将探针标记至Tn抗原，避免传统两步法中额外的CuAAC点击化学反应。其中，Cy3探针用于荧光成像，生物素探针结合LC-MS/MS实现糖蛋白富集与位点分析，探针中的硫醇可切割S-S键提升糖蛋白组鉴定的效率与准确性。
（2）技术流程
该策略通过“探针T-合成酶反应体系构建→样本标记（细胞裂解液/活细胞/血清/组织）→荧光成像或亲和素珠富集→LC-MS/MS分析”流程，实现Tn抗原的可视化、富集及位点特异性定位，技术框架如图1所示。
图1. 用于Tn抗原可视化、富集和定位的一步酶促策略概述
2、技术性能验证与对比
（1）灵敏度与效率提升
一步法较传统方法显著优化：5 μg Jurkat细胞裂解液经一步法标记的信号强度超过传统VVA方法检测40 μg样本的10倍，对牛下颌腺黏蛋白(BSM)的检测灵敏度提升至少100倍。荧光凝胶（图2A）显示，一步法标记的Tn糖蛋白（如>70 kDa大分子）荧光信号强于两步法；Western blot（图2B）证实，一步法通过生物素探针III标记的糖蛋白信号更强、背景更低。与VVA对比（图2C）可见，5 μg一步法标记的BSM样本可清晰检测，而40 μg VVA检测几乎无信号，验证了一步法在低丰度样本中的检测优势。
图2. Tn糖蛋白一步酶促标记的效率评估
（2）多场景适用性
活细胞标记：共聚焦显微镜（图3A）和流式细胞术（图3B）显示，一步法可通过荧光探针II特异性标记Jurkat活细胞表面的Tn抗原，标记的糖蛋白在活细胞中以>70 kDa大分子为主，在细胞裂解液中则以< 100 kDa中小分子为主（图3C）。
临床样本：在人血清和宫颈组织裂解液中，一步法通过T-合成酶催化实现Tn抗原的特异性标记，为临床诊断提供潜在应用价值。
图3. 活Jurkat细胞上Tn抗原的一步酶促标记
3、技术应用：Tn糖蛋白组的定位与分析
（1）糖蛋白与糖基化位点鉴定
实验流程如图4A所示，包括细胞裂解、酶促标记、胰蛋白酶消化、亲和素珠生物素富集及LC-MS/MS分析。利用可切割生物素探针III标记HEK293Fᵀⁿ⁺和 Jurkat细胞裂解液，经上述流程后，成功鉴定出454个Tn糖蛋白和624个Tn糖基化位点，其中28个蛋白在两细胞系中共同表达（图4B）。
（2）糖蛋白分布特征
生物信息学分析显示，Tn糖蛋白主要富集于细胞膜和细胞外外泌体，极少存在于内质网，符合其作为分泌型糖蛋白的生物学特性（图4C）。糖基化位点中86%为Ser/Thr-Tn肽段，14%为Tyr-Tn肽段，且包含单个及簇状Tn位点，表明该方法可突破传统抗体对肽段表位的依赖，直接标记Tn抗原本身。
图4. 通过LC-MS/MS对Tn糖蛋白的鉴定
4、技术价值与展望
（1）创新性
该研究首次开发Tn抗原的一步酶促标记策略，较传统方法灵敏度提10-100倍，操作流程从两步简化为一步，并实现“可视化-富集-定位”功能整合，为糖生物学研究提供突破性工具。
（2）应用潜力
癌症诊断：血清和组织中Tn抗原的高效检测可作为新型诊断标志物，补充现有临床检测体系；
机制研究：精准定位624个Tn糖基化位点，为揭示肿瘤发生中的糖基化调控机制提供数据支撑；
药物开发：通过Tn糖蛋白组分析，可筛选潜在免疫治疗靶点，推动抗体药物研发。
