英文标题：Integrated serum pharmacochemistry and network pharmacology to explore the mechanism of Yi-Shan-Hong formula in alleviating chronic liver injury

发表期刊：Phytomedicine

影响因子：8.3

研究背景

慢性肝损伤(Chronic liver injury, CLI)是一类常见的肝病进展性病理过程，以肝纤维化和肝硬化进展为特征，最终可致肝脏再生能力下降。约60%的CLI患者存在系统性炎症，可能引发多器官衰竭。传统中药依山红方剂(Yi-Shan-Hong, YSH)由广西5种道地药材配伍而成，临床治疗慢性肝损伤（尤其乙肝诱发损伤）安全且有效，但其活性成分、作用靶点及分子机制尚未明确。

因此，研究团队通过整合血清药物化学与网络药理学技术，结合动物实验，系统探究YSH治疗CLI的物质基础与核心机制。

研究概览

研究方法

1、血清药物化学分析

采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra High Performance Liquid Chromatography system, equipped with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS)，检测YSH水提取物及SD大鼠(n=6)连续口服YSH7天后的血清样本，鉴定真正入血发挥作用的活性成分。

2、网络药理学分析

通过TCMSP、ETCM数据库获取YSH活性成分潜在作用靶点，GeneCards、OMIM数据库获取CLI相关靶点。利用STRING构建蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络，筛选核心靶点。通过R包进行GO功能富集和KEGG通路分析。最终构建“化合物-靶点-疾病”网络。

3、动物实验验证

腹腔注射d-(+)-半乳糖胺盐酸盐(d-(+)-galactosamine hydrochloride, d-GalN)以诱导大鼠CLI，后分别给予高、中、低剂量YSH及联苯双酯(Bifendate, BFD0干预（每组n=10）。检测血清肝功能指标、肝组织病理、氧化应激指标、炎症因子、肝纤维化标志物及通路关键分子表达的变化。

研究结果

1、活性成分鉴定

通过UPLC-Q-TOF-MS方法（图1），基于保留时间、碎片离子的质荷比及包含YSH五味药材的相关文献，从YSH提取物及血清中成功鉴定出了25种化合物，包括没食子酸、己内酰胺、海帕霍林、苯甲酸、维塞宁-2、沙夫托苷、异沙夫托苷、维西宁III、阿魏酸、异槲皮苷、长春毒苷B、槲皮苷、槲皮素、3-O-甲基槲皮素、萼花素、沃戈宁、熊胆酸、3,4,2'，4'-四羟基查尔酮、去氨基酪氨酸、纳多西酮、熊果苷、单棕榈素、亚油酸、棕榈酸和豆甾醇（图2）。这25种成分源自方剂中的满山红(ManShanHong, MSH)、毛鸡骨草(MaoJiGuCao, MJGC)、田基黄(TianJiHuang, TJH)、黄根(HuangGen, HG)和牛大力(NiuDaLi, NDL)5种草药，其中9种成分已在前期MJGC相关研究中被发现（表1）。

图1 YSH提取物和含药血清的总离子流图

表1 YSH水提取物和大鼠血清中鉴定到的植物化学成分

图2 YSH水提取物和大鼠血清中鉴定到的成分的化学结构

2、靶点预测与PPI分析

为了探究YSH的作用机制，研究人员基于TCMSP、ETCM数据库筛选出同25个活性成分相关的277个靶点，通过GeneCards、OMIM数据库获取397个CLI相关靶点，取交集得到22个共同靶点，包括CHRM3, GSK3B, CNR1, CNR2, HNF4A, INS, SREBF1, TLR4, HDAC9, EGFR, VEGFA, RB1, IL6, PRKCA, CAV1, MYC, ALOX5, NFE2L2, IGFBP3, IGF2, NR1I2和PIK3CG。PPI网络图含190条边（图3A），IL6、INS的相互作用频率最高（17次）（图3B）。利用Cytoscape构建的化合物-靶点网络可见活性成分同潜在作用靶点的关联（图3C）。总的来说，这22个靶点有可能在YSH的治疗中发挥重要作用。

图3 YSH活性成分及其潜在靶点在CLI治疗中的相互作用

3、潜在GO和KEGG信号通路预测

为了更好的理解功能分子及其潜在的关联，研究人员进行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析可见25个GO条目（图4A），包括DNA结合转录因子结合、蛋白激酶调节因子活性和DNA结合转录激活因子活性。这表明YSH可通过调节各种生物过程，尤DNA结合转录，以发挥治疗作用。KEGG富集分析可见89条通路，PI3K-AKT(hsa04151)、肝细胞癌(hsa05225)和HIF-1信号通路(hsa04066)等20条信号通路更为显著（图4B）。尤为突出的是，45.5%的靶点参与PI3K/AKT信号通路（图4C），31.8%的靶点与肝细胞癌信号通路相关，27.3%的靶点与HIF-1信号通路相关。这表明，靶点主要聚集在PI3K/AKT信号通路上，且与炎症和肝细胞癌有潜在关联。总的来说，YSH显著影响CLI病理过程所涉及的通路。

图4 YSH治疗CLI的潜在GO和KEGG信号通路预测

4、肝功能与组织病理改善

为了证实YSH对CLI的治疗作用，研究人员建立了CLI的大鼠模型。与对照组相比，模型组血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平显著升高(P<0.01)，而高、中、低YSH剂量组(YSH-H，YSH-M，YSH-L)和BFD组的ALT和AST水平较之模型组降低（图5A-B）。模型组总蛋白(total protein, TP)和白蛋白(albumin, ALB)水平略低，但无明显差异（图5C-D）。

对照组肝组织呈红棕色，表面平滑柔软，而模型组肝脏呈现大面积暗红区，伴毛细血管增厚，表面不平伴小凸块，触诊时略显坚硬；YSH-H、YSH-M组及BFD组肝脏色泽及表面特征无异常，而YSH-L组肝脏表面触诊略坚硬（图5E）。H&E染色结果显示（图5F-G），对照组肝小叶正常，肝细胞有序排列。相比之下，模型组小叶结构紊乱，肝细胞肿胀伴有点状坏死和炎症浸润。此外，肝窦内出现淤血，胆管发生增生。BFD组及YSH-H、YSH-M组中，肝脏基底小叶结构正常，肝细胞排列有序。YSH-L组大鼠肝脏周边小叶的肝细胞出现嗜酸性变，胆管内可见点状坏死和增生。

图5 YSH改善肝脏功能与组织病理变化

5、氧化应激与炎症反应缓解

为了分析氧化应激反应的变化，研究人员评估了肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)的含量（图6A-C）。模型组SOD、GSH-PX水平显著降低，MDA水平升高，而YSH-H组SOD、GSH-PX活性升高，MDA水平降低，这表明肝脏氧化应激反应被抑制。YSH-M、YSH-L组SOD和MDA也有一定程度恢复，BFD组MDA显著下降，GSH-PX水平上升。

血清炎症因子检测显示，与对照组相比，模型组肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)水平显著升高。YSH各剂量组呈剂量依赖性降低这些因子水平（图6D-F）。结果表明，应用YSH可抑制d-GalN诱导的炎症细胞因子的上调。

图6 YSH可减轻CLI大鼠的氧化应激和炎症反应

6、肝纤维化减轻

为了评估肝纤维化的程度，测定了血清透明质酸(hyaluronic acid, HA)、III 型前胶原(type III procollagen, PCIII)和羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)的含量。模型组中HA和PCIII显著升高（图7A-B），表明CLI处于进行性纤维化状态。相比之下，BFD、YSH-H和YSH-M组的血清HA和PCIII水平显著降低。患CLI的Hyp水平轻微下降，但未发现明显差异（图7C）。天狼星红染色结果与生化检测的类似（图7D-E）。在常规显微镜下，天狼星红染色显示出粉红色胶原纤维；在偏光显微镜下，I型胶原纤维呈现红色和橙色，而III型胶原纤维显示黄色和绿色。对照组在肝汇合处仅显示出少量I型胶原纤维，而模型组主要显示肝细胞汇合处III型胶原纤维增生。BFD、YSH-H和YSH-M组大鼠的肝汇合处胶原增生减少，仅剩少量I型胶原。YSH-L组肝脏汇合处观察到极少量III型胶原。

转化生长因子-β(transforming growth factor beta, TGF-β)是肝纤维化进展的重要因素。TGF-β的高表达和过度活化可导致肝细胞损伤和死亡，促进炎症反应，并引发纤维化。在模型组中，大鼠肝脏坏死区域的TGF-β1水平升高。使用BFD、YSH-H和YSH-M治疗可降低TGF-β1蛋白表达。与模型组相比，YSH-L组的TGF-β1表达水平有所降低（图7F）。

图7 YSH缓解CLI大鼠的纤维化水平

7、PI3K/AKT通路调控验证

鉴于PI3K/AKT通路在抗CLI中发挥重要作用，研究采用免疫荧光技术评估YSH对PI3K/AKT信号通路的影响。与对照组相比，模型组肝组织中p-AKT/AKT显著升高，揭示PI3K/AKT信号通路被激活。相反，接受BFD或YSH处理的大鼠显示p-AKT/AKT显著降低（图8），这表明YSH可显著抑制d-GalN诱导CLI的AKT磷酸化，这与血清药理化学和网络药理学分析的结果一致，证实PI3K/AKT通路是YSH发挥肝保护作用的关键分子机制。

图8 YSH对大鼠肝组织中AKT活化的影响

研究结论

本研究首次明确YSH缓解慢性肝损伤的物质基础为25种入血活性成分，核心机制是通过靶向PI3K/AKT信号通路，协同改善肝功能、抑制氧化应激、炎症反应及肝纤维化（图9）。该成果为YSH的临床应用提供了科学依据，同时建立了“血清成分鉴定-网络预测-实验验证”的中药复方机制研究范式，助力中药从经验医学向精准医学转化。

图9 YSH对d-GalN诱导的CLI的分子作用机制的示意图

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