英文标题：Effects of different concentrations of biological maturity agents on nitrogen and microbial diversity of Auricularia heimuer residue compost
发表期刊：Bioresource Technology
影响因子：9
客户单位：吉林农业大学
百趣提供服务：宏基因组测序
研究背景
本研究通过在黑木耳菌渣堆肥过程中添加不同浓度的生物腐熟剂，探究其对黑木耳菌渣堆肥过程的影响。通过测定堆肥过程中理化指标及微生物多样性的变化，结果表明，添加生物腐熟剂对堆肥温度、湿度、pH、种子发芽指数、活力指数有一定的促进作用，为实际应用奠定基础。
研究结果
1、不同浓度生物腐熟剂对堆肥温度、湿度、pH值及电导率的影响
研究设置了5个组别，A：对照组，无生物腐熟剂；B：0.1%生物腐熟剂；C：0.2%生物腐熟剂；D：0.3%生物腐熟剂；E：0.4%生物腐熟剂。
温度是启动和进行堆肥过程的关键指标，添加微生物肥料发酵剂的堆肥温度在每个时间段都高于A组。从图1可以看出，添加生物腐熟剂的处理组堆温均高于对照组，且受环境温度波动影响明显，表明添加少量或大量生物腐熟剂均有助于堆肥升温，利于底物生物转化和杀灭病原微生物。
各处理组湿度差异较小，初期因温度升高导致水分蒸发而下降，后期受天气影响波动，最终随温度回升再次降低，符合堆肥过程中水分蒸发大于生成的特点。
pH整体呈上升趋势，E组最终pH最高，A组波动较大，后期与其他组差异显著。pH升高与微生物活动产生的碱性阳离子积累及含氮复合物矿化有关，影响微生物活性和氮素形态。与其相反，电导率(EC)全程下降，B组降幅最大，E组降幅最小，表明堆肥对植物无毒。EC下降与氨挥发、矿物盐沉淀及小分子转化为腐殖质大分子有关。
图1 不同浓度生物腐熟剂对堆肥过程中温度、水分、pH值和电导率的影响
2、不同浓度生物腐熟剂的堆肥材料对种子发芽指数和活力指数的影响
种子发芽指数(GI)和活力指数(VI)是评估堆肥成熟度和植物毒性的重要指标（图2a-b）。第5天时，B组GI最高，E组最低，可能是在初期高浓度腐熟剂对种子有抑制作用；第10天后，E组GI显著上升并与B组无明显差异；第35天，B组GI显著低于其他组，而E组因腐熟剂充分分解菌渣，对种子发芽的促进作用更显著。这表明添加生物腐熟剂可加速NH3、有机酸等有毒物质的去除。堆肥前期VI明显上升，各组差异显著；末期除C组VI显著高于其他组外，B组VI最低且与其他组差异显著，说明添加适量腐熟剂能更有效提升种子活力。
图2 不同浓度生物腐熟剂对堆肥过程中发芽指数(GI)、挥发性指数(VI)、总氮(TN)、铵态氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)、有机质(OM)和总有机碳(TOC)的影响
3、不同浓度生物腐熟剂对堆肥理化指标的影响
氮素转化方面，总氮(TN)含量波动较大，堆肥结束时A组最高，E组最低，表明一定的堆肥时间利于氮素转化，高浓度腐熟剂可能加速氮素损耗；铵态氮(NH4+-N)在25天内达峰值，与温度升高促进含氮物质氨化有关，末期各组差异不显著；硝态氮(NO3--N)变化较小，末期高于初始值（图2c-e）。
有机质(OM)和总有机碳(TOC)整体呈上升趋势，35天时B组OM最高，E组最低，说明高浓度腐熟剂对有机质分解作用更强；与其他研究中总有机碳下降不同，本研究可能受通气条件影响（图2f-g）。
B、E组总腐殖质碳低于初始值，A组与初始值无显著差异；腐殖酸碳含量B组最高，显著高于A组；胡敏素碳和E4/E6比值在A、B、E组均显著高于初始值，表明腐熟剂促进腐殖质形成，利于土壤肥力提升（表1）。
E组有效磷和有效钾含量最高，A组最低且与初始差异显著，说明腐熟剂可维持养分；B、E组木质素、纤维素和半纤维素含量显著低于A组，说明高浓度腐熟剂更利于木质纤维素降解（表2-3）。
添加腐熟剂的处理组中有益微量元素含量与初始无显著差异，A组则低于初始；镉、汞等重金属含量下降，说明腐熟过程中有机物官能团络合及pH升高促进了重金属的固定（表4）。
表1 堆肥前后腐殖质含量的变化
表2 堆肥前后有效磷和钾含量的变化
表3 堆肥前后木质纤维素含量的变化
表4 堆肥前后微量元素含量的变化
4、不同浓度生物腐熟剂对堆肥微生物多样性的影响
研究通过宏基因组分析生物腐熟剂对微生物丰度的影响。从门水平看，堆肥前，优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门等；堆肥至25天，A、B、E组的变形菌门、拟杆菌门丰度降低，表明添加适量生物腐熟剂可降低这两类菌门的丰度（图3a）。从属水平看，堆肥前，优势属为假黄单胞菌、博德特氏菌等；堆肥后期，优势属变为藤黄单胞菌、砂单胞菌等。其中，藤黄单胞菌作为典型植物病原菌，堆肥后丰度显著降低，且随堆肥时间延长降幅更明显，表明堆肥可减少有害微生物，增加有益菌丰度（图3b）。
堆肥第0天，黄单胞菌科和假黄单胞菌的有效基因数最高，随堆肥进行，科和属的有效基因数显著下降（图3c）。与氮循环相关的根瘤菌科基因数随堆肥时间减少，与氮含量下降的理化结果一致；慢生根瘤菌科多数基因数上升，可能对氮积累有抑制作用。堆肥第0天与堆肥过程中属水平微生物群落差异显著（图3d），表明不同浓度腐熟剂对不同时期细菌群落丰度影响程度不一。
门水平PCA结果表明各样本组内平行性良好，组间差异明显（图3e），NMDS分析结果则进一步验证了堆肥对微生物群落结构的显著影响（图3f）。不同处理间特有基因的数量差异显著（图3g），表明堆肥时间显著影响特有基因的数量，这可能与腐熟剂加速物质降解导致部分物种基因丢失有关。
图3 物种在门和属水平的分析图
从图4结果可看出，堆堆肥天数和腐熟剂浓度对样本功能差异影响明显。KEGG分析显示了丰度最高的前45条同源基因代谢通路，各代谢通路的丰度在堆肥后期下降；eggNOG注释结果表明，E组的防御机制基因(V)丰度较高，可能激活堆肥中有害物质降解机制，而与氨基酸运输代谢、能量生产等相关的基因丰度随堆肥下降；CAZy分析结果表明，糖苷水解酶(GH)、糖基转移酶(GT)等6类酶基因经过堆肥过程富集，A组和E组的酶基因数量高于B组，CK组的CAZy总丰度显著高于处理组，其中GH、GT、CBM类酶基因数较多，对促进堆肥腐熟起重要作用。
图4 基于Bray Curtis距离的功能丰度聚类树及注释
作者基于差异分析筛选出12种差异显著的酶（图5a），并挑出35种高丰度酶（图5b），初始堆肥的糖基转移酶丰度较高，合酶丰度较低；第25天的A组各类酶丰度较低，且随堆肥时长进一步下降；第25天的B组和E组合酶丰度较高，且随堆肥呈上升趋势，说明添加生物腐熟剂可增加酶丰度，且该趋势随堆肥时间延长更明显。PCA图结果也表明腐熟剂浓度和堆肥天数对酶丰度有显著影响（图5c）。
图5 不同处理间差异分析
从图6a可知，初始堆肥（D0.CK组）的抗性基因种类最多且丰度最高，表明未处理的黑木耳菌渣中抗性基因污染较严重。随堆肥进行，13种抗性基因的丰度均下降，其中添加生物腐熟剂的处理组下降更显著，说明堆肥（尤其是添加腐熟剂）对降低抗性基因有重要作用。
adeF基因丰度最高（图6b），其作为外排系统编码基因，可能通过参与抗生素抗性基因外排，导致其他抗性基因丰度显著降低；主要抗性机制包括抗生素外排、灭活及靶标改变，变形菌门、拟杆菌门等是抗性基因的主要宿主菌（图6c-d）。
图6 不同处理间样本中不同抗生素耐药性基因(ARO)的丰度分析图
研究结论
本研究表明生物腐熟剂的应用通过调控微生物群落和抗性基因变化，为黑木耳菌渣的安全资源化利用提供了科学依据，证实了应用科学在自然界不同领域的重要性。
宏基因组测序：利用新一代高通量测序技术，以特定环境中微生物群体的全部基因组为研究对象，在解析微生物多样性、种群结构及进化关系的基础上，进一步探究微生物群体的功能活性、种间协作机制及与环境的互作关系，从而发掘其潜在的生物学价值。与传统微生物研究方法相比，宏基因组测序技术规避了传统方法中绝大部分微生物难以纯培养、痕量菌群无法有效检测的技术局限。
