英文标题：Pharmacological inhibition of PSPH reduces serine levels and epileptic seizures

中文标题：磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)的药理学抑制可降低丝氨酸水平并减少癫痫发作

发表期刊：nature chemical biology

影响因子：13.7

客户单位：中国医学科学院基础医学研究所

百趣提供服务：600MRM(现升级为AQ700高通量靶标定量)

研究背景

颞叶癫痫(TLE)是最常见的难治性癫痫类型，降低N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)配体水平被认为是治疗TLE的潜在策略。D-丝氨酸可激活海马体中的突触NMDAR，但它对癫痫发作的影响尚不明确。

中国医学科学院基础医学研究所许琪教授团队在nature chemical biology上发表了题为“Pharmacological inhibition of PSPH reduces serine levels and epileptic seizures”的研究文章。研究发现：清除D-丝氨酸或阻断其与NMDAR的结合可抑制小鼠模型的癫痫发作。星形胶质细胞来源的 L-丝氨酸通过磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)调控胞外D-丝氨酸水平和癫痫发作活性，据此研究人员鉴定出一种强PSPH抑制剂Z218484536，该抑制剂可减少TLE小鼠模型和TLE食蟹猴模型的自发性癫痫放电。

这些结果表明PSPH是治疗TLE的潜在治疗靶点，支持Z218484536进一步的临床前研究。

研究结果

01 D-丝氨酸对海人酸(KA)诱导的急性癫痫发作至关重要

已知D-丝氨酸是海马体突触NMDAR的主要共激动剂，但它在TLE中的具体作用尚未明确。

为厘清这一问题，研究人员首先分析了临床样本：对比非TLE 捐赠者、无海马硬化(HS)的TLE患者及有HS的TLE患者的海马组织，发现有HS的TLE样本中，谷氨酸和丝氨酸水平显著高于正常样本和无HS的TLE样本，而甘氨酸水平在各组间无差异(图1a-c)。

随后，研究人员建立KA诱导的TLE小鼠模型，单侧海马注射KA 4周后，小鼠海马体中的L-丝氨酸和D-丝氨酸水平均较对照组明显升高(图1d-g)。

为明确D-丝氨酸对癫痫发作的直接影响，研究人员另向清醒小鼠单侧海马注射7ng KA，成功诱导出多次非惊厥性癫痫发作(少数小鼠出现惊厥性发作，图1h)；在此基础上进行干预实验：

1.补充低剂量D-丝氨酸后，癫痫发作潜伏期显著缩短，发作次数和持续时长明显增加(图1i-k)；

2.注射D-氨基酸氧化酶(DAAO)降解体内D-丝氨酸，可几乎完全抑制KA诱导的急性癫痫发作，而热灭活的DAAO(hiDAAO)无此效果(图1i-m)；

3.使用NMDAR甘氨酸调节位点拮抗剂7-氯犬尿氨酸(7-CKA)阻断D-丝氨酸与NMDAR的结合，同样能抑制癫痫发作，且甘氨酸本身无促癫痫作用(排除了7-CKA通过竞争甘氨酸发挥作用的可能)；

4.特殊情况下，补充高剂量D-丝氨酸反而会抑制癫痫发作(图1i-m)，这一现象与高剂量D-丝氨酸竞争性结合NMDAR的谷氨酸结合位点有关，属于人为药理干预效应，并非TLE病理状态下的主要机制。

综上，D-丝氨酸对KA诱导的急性癫痫发作至关重要：TLE病理状态下，D-丝氨酸水平异常升高会促进癫痫发作；而通过降解D-丝氨酸(如DAAO)或阻断其与NMDAR的甘氨酸调节位点结合，可有效发挥抗癫痫效应。

图1.D-丝氨酸促进KA诱导的急性癫痫发作

02 D-丝氨酸耗竭抑制慢性癫痫发作

为深入研究D-丝氨酸对TLE慢性病程的调控作用，研究人员对KA诱导的慢性TLE小鼠模型植入硬膜下螺钉电极和海马注射套管(扩展数据图1a)，连续记录20小时脑电图以获取基线海马阵发性放电(HPDs)后，分别注射相关试剂进行干预。

结果显示：

1.与溶媒组(Vehicle组)相比，注射DAAO降解D-丝氨酸可在后续12小时显著抑制HPDs(扩展数据图1b-g)；

2.NMDAR甘氨酸调节位点拮抗剂7-CKA同样能显著抑制HPDs(扩展数据图1h-j)；

3.额外注射D-丝氨酸未增加HPDs频率(扩展数据图1k-m)，推测可能因TLE小鼠的NMDAR已被内源性升高的D-丝氨酸饱和；

4.注射甘氨酸对HPDs无明显影响(扩展数据图1n-p)，进一步证实TLE慢性发作中D-丝氨酸而非甘氨酸是调控NMDAR活性的关键共激动剂。

5.综上，升高的D-丝氨酸可促进TLE慢性癫痫发作，耗竭D-丝氨酸或阻断其与NMDAR的结合具有强效抗慢性癫痫作用，且该效应具有特异性。

扩展数据图1.D-丝氨酸调控自发性复发性癫痫发作

03 D-丝氨酸耗竭减弱CA2神经元癫痫样放电

严重HS患者的海马体中，CA2亚区和齿状回(DG)的神经元丢失程度显著低于其他区域，因此CA2亚区、DG及下托被推测是癫痫发作起始和扩散的关键区域。

为明确D-丝氨酸耗竭产生抗癫痫效应的神经生理学机制，研究人员开展了针对性的电生理实验。

首先对正常小鼠的海马脑切片进行处理，通过膜片钳技术记录DG、CA2和下托神经元的电活动(图2a)；同时利用Cre依赖型腺相关病毒(AAV2-hSyn-DIO-GFP)在Amigo2-Cre小鼠的海马体中特异性标记CA2神经元(补充图2)，为精准记录CA2神经元电信号提供基础。

实验中，使用特异性阻断电压门控钾通道的4-氨基吡啶(4-AP)处理脑切片，成功诱导出癫痫标志性的细胞级表现——阵发性去极化漂移(PDS)，其特征为神经元短暂去极化并引发一连串动作电位(图2b)。

在此基础上进行干预实验，结果如下：

1.向脑切片浴槽中灌流NMDAR甘氨酸调节位点拮抗剂7-CKA，可显著抑制CA2神经元的4-AP诱导PDS，洗去7-CKA后抑制效应消退(图2c-e)；

2.灌流DAAO降解D-丝氨酸，同样能强烈抑制CA2神经元的PDS(图2f-i)； 

3.对比其他脑区神经元：7-CKA和DAAO对DG神经元的PDS仅表现出有限抑制作用(扩展数据图2a-d)，对下托神经元的PDS则无明显抑制效应(扩展数据图2e-h)；

4.在KA诱导的慢性TLE小鼠海马脑切片中，重复上述实验，得到一致结果：7-CKA和DAAO仍仅特异性抑制CA2神经元的4-AP诱导PDS(图2k-q)，对DG和下托神经元无显著影响(扩展数据图2i-p)；

5.补充剂量依赖性实验：低剂量D-丝氨酸孵育可增强4-AP诱导的CA2神经元PDS(扩展数据图3a-c)，高剂量D-丝氨酸则抑制该PDS(扩展数据图3d-f)，与前述脑电图研究中不同剂量D-丝氨酸对癫痫发作的调控效应一致。

图2.海马D-丝氨酸耗竭抑制4-AP诱导的CA2区神经元PDS

扩展数据图2.7-CKA和DAAO对DG和海马下神经元4-AP诱导的PDS的影响有限

扩展数据图3.外源性D-丝氨酸对4-AP诱导的PDS的影响

04 星形胶质细胞来源的L-丝氨酸调控癫痫发作

研究发现，正常小鼠和TLE模型小鼠的海马体中，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)标记的星形胶质细胞均未检测到SR信号(图3a)，提示星形胶质细胞仅作为L-丝氨酸产生者。

L-丝氨酸的调控路径为：星形胶质细胞通过丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体1/2(ASCT1/2)释放 L-丝氨酸，神经元经 A型氨基酸转运体1/2(ATA1/2)摄取后转化为D-丝氨酸，再通过神经元Asc型氨基酸转运体1(Asc1)释放并结合 NMDAR(图3b)。

为验证其作用，研究通过反向微透析向海马体递送海人酸(KA)及上述转运体抑制剂，同时记录脑电图(EEG)并检测透析液丝氨酸水平(图3c-d)。

结果显示，KA灌注1小时可诱导5-7次HPDs(图3f-g)；联合L-4-氟苯甘氨酸(L-4FPG)抑制ASCT1/2可完全阻断HPDs，补充外源性L-丝氨酸可逆转该抑制作用(图3h-i)；进一步用谷氨酰胺抑制ATA1/2或BMS-466442阻断Asc1，均再次显著抑制HPDs(图3j-k)，组间统计表明调控丝氨酸穿梭通路对癫痫发作有显著影响(图3l)。

透析液检测显示，L-4FPG可阻止KA诱导的L-丝氨酸和D-丝氨酸升高，即使存在L-4FPG，补充外源性L-丝氨酸仍可使D-丝氨酸上升，后续加入谷氨酰胺或BMS-466442则阻断该效应(图3m-n)。

综上，星形胶质细胞来源的L-丝氨酸通过丝氨酸穿梭通路，正向调控间质D-丝氨酸水平和癫痫发作活性。

图3.星形胶质细胞来源的L-丝氨酸调节D-丝氨酸水平与癫痫发作

05 PSPH调控L-丝氨酸水平和癫痫发作活性

已知L-丝氨酸在星形胶质细胞中由糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸经三步反应合成，依次由PHGDH、PSAT1和PSPH催化(图4a)。选择PSPH作为治疗靶点的依据为：敲低PSPH后，细胞内和细胞外L-丝氨酸水平的下降幅度显著大于敲低PHGDH或PSAT1(图4b-c、扩展数据图4a-f)；PSPH在海马体中高表达(图4d)。

为验证PSPH表达与神经元活性的关联，向野生型小鼠注射戊四氮(PTZ)诱导海马体神经元激活，Western blot显示PSPH蛋白水平显著升高，预先注射水合氯醛(CH)可完全抑制该上调(图4e)，证实PSPH上调由神经元激活引发。

TLE患者和慢性TLE小鼠的海马体星形胶质细胞中，PSPH水平异常升高，而PHGDH和PSAT1水平无显著变化(图4f-g、扩展数据图4g-j)。

通过AAV5-gfa104-PSPH-IRES-eGFP在正常小鼠海马体星形胶质细胞中过表达PSPH(PSPH OE)，海马体胞外L-丝氨酸和D-丝氨酸水平显著升高(图4i-j)，PSPH OE小鼠更易发生KA诱导的急性癫痫发作(图4k-n)。

相反，通过AAV5-gfa104-miPSPH-eGFP特异性敲低星形胶质细胞中的PSPH，可降低海马体胞外L-丝氨酸和 D-丝氨酸水平(图4o-q)，并减轻PTZ诱导的急性癫痫发作严重程度(图4r-u)。

综上，PSPH是星形胶质细胞中L-丝氨酸从头合成的关键调控因子，靶向PSPH可通过降低丝氨酸水平减少癫痫发作。

图4.PSPH在TLE中上调，并调节细胞外L-丝氨酸和D-丝氨酸以及癫痫发作

扩展数据图4.TLE中PHGDH和PSAT水平未发生变化

06 PSPH抑制剂的鉴定与表征

已知PSPH是星形胶质细胞L-丝氨酸从头合成的关键调控因子，但强效抑制剂尚未明确。研究通过高通量虚拟筛选(HTVS)，从216万余个化合物中筛选出20个候选物，体外酶活性实验证实4种可剂量依赖性抑制PSPH活性(图5a-d、扩展数据图5a)。

在PTZ诱导的急性癫痫模型中，仅Z218484536表现出剂量依赖性抗癫痫效应，4mg/kg剂量时效果最佳(图5e-g)；其余3种化合物无活性，而PHGDH抑制剂NCT-502的阳性对照结果，支持靶向丝氨酸合成通路的治疗潜力(图5h-p、补充图3a-f)。

进一步表征显示，Z218484536与PSPH的A51、D22等位点形成多重相互作用，微量热泳动(MST)分析证实其解离常数(Kd)约0.23μM，为竞争性抑制剂(图5q、扩展数据图5b-c)。该药药代动力学特性良好，腹腔注射4mg/kg后血浆暴露充分、半衰期2.7h，脑-血浆比0.33(可穿透血脑屏障)，且安全性优异(扩展数据图5d-m)。

体外实验中，Z218484536抑制星形胶质细胞 L-丝氨酸释放及胞内合成的IC50分别为0.4μM和0.38μM(图5r-s)；在KA-TLE小鼠模型中，连续腹腔注射可显著降低海马体L-丝氨酸和D-丝氨酸水平，且不影响外周血清氨基酸水平(图5t-u、扩展数据图5n-o)。

综上，Z218484536与PSPH结合亲和力强、血脑屏障穿透性好，体内外均能有效降低丝氨酸水平且安全性良好，是潜在抗癫痫候选化合物。

图5.虚拟筛选和实验验证确定了新的PSPH抑制剂

扩展数据图5.Z218484536的分子对接、药代动力学(PK)及毒理学数据

07 Z218484536的靶点选择性

为验证PSPH抑制剂Z218484536的特异性及无脱靶效应，研究开展多维度验证：

位点突变实验显示，Z218484536结合的PSPH氨基酸位点(D22、K158等)高度保守(扩展数据图6a)；关键位点突变后，PSPH活性显著改变，且Z218484536与突变型PSPH的结合亲和力下降26倍，对L-丝氨酸的抑制作用消失(扩展数据图6b-f)。

靶标代谢组学分析表明，Z218484536仅影响7种代谢物，仅降低L-丝氨酸、甘氨酸水平并蓄积O-磷酸-L-丝氨酸，无广泛代谢紊乱(补充图4a-i)；蛋白质组学显示其与PHGDH抑制剂分子作用不同，无共同靶点(补充图4j-m)。

体内实验证实，沉默PSPH后Z218484536的抗癫痫效应消失，且该效应可被预注射D-丝氨酸阻断(扩展数据图6k-n)；其光亲和探针无法结合PSPH(补充图5a-e)。

磷酸酶面板检测显示，Z218484536仅在30μM时微弱抑制DUSP22，对其他24种磷酸酶无作用(补充图6)。

综上，Z218484536对PSPH具有高度选择性，通过特异性结合降低L-丝氨酸和D-丝氨酸水平，无明显脱靶效应。

扩展数据图6.Z218484536的靶向结合

08 Z218484536抑制TLE小鼠的自发性癫痫发作

已知Z218484536在体外和急性模型中有效，需验证其对慢性TLE小鼠自发性癫痫的抑制作用及安全性。研究利用KA-TLE小鼠模型，KA诱导4周后 ，植入有线脑电图电极监测自发性临床电癫痫发作(SESs)(图6a-e)。先记录3周基线SES频率，随后进行7周载体、拉莫三嗪(LTG)或Z218484536处理(图6b-e)。

结果显示，载体组SES频率渐进升高(图6b, f, g)；LTG组第1周显著降低SES频率，但效力逐渐下降(图6c, f, h)；Z218484536可阻止SES频率升高但仍高于基线(图6d, f, i)，而4mg kg⁻¹ 剂量可将SES频率降至0.44±0.15次/天，较基线降低75%(图6e, f, j)。

安全性方面，LTG和Z218484536(4mg kg⁻¹)均不导致小鼠体重下降(图6k)；Z218484536(4mg kg⁻¹)处理组小鼠的肝肾功能损伤血清生物标志物(AST、ALT、BUN、肌酐)水平与溶媒组无显著差异(图6l-o)。

综上，Z218484536可有效抑制慢性TLE小鼠的自发性癫痫发作，且安全性良好，有望成为TLE的长期治疗干预手段。

图6.Z218484536在慢性颞叶癫痫(TLE)KA小鼠模型中具有抗癫痫作用

09 Z218484536抑制TLE食蟹猴模型的癫痫棘波

已知食蟹猴TLE模型更贴近人类病理特征，且海马注射KA诱导的慢性癫痫状态无明显惊厥症状，故以癫痫棘波频率作为抗癫痫活性评估指标(扩展数据图7a)。

研究选用6只食蟹猴，建立KA-TLE模型；最后一次KA注射1个月后，记录脑电图以确定基线癫痫棘波频率(扩展数据图7b)，三次基线记录显示棘波频率均稳定(扩展数据图7c)。

随后猴子每日腹腔注射溶媒或Z218484536，治疗2周后首次评估疗效，后续每月复查一次。

结果显示，溶媒组全程癫痫棘波频率无降低(扩展数据图7d)；按种间剂量换算，初始给予1mg・kg⁻¹Z218484536 2周后，棘波频率较基线略有下降(扩展数据图7e)；剂量增至2mg・kg⁻¹后，至3.5个月时棘波频率较基线降低80%(扩展数据图7e)。注射后1小时，Z218484536的平均血浆浓度为254.8ng/ml(扩展数据图7f)。

综上，Z218484536可有效降低TLE食蟹猴模型的癫痫活性，为其作为人类TLE潜在治疗药物提供了有力的非人灵长类动物实验证据。

扩展数据图7.Z218484536在颞叶癫痫(TLE)食蟹猴模型中抑制癫痫放电

研究结论

本研究明确D-丝氨酸及其前体L-丝氨酸在TLE中起关键作用，通过遗传和药物遗传学抑制手段，证实降低星形胶质细胞来源的L-丝氨酸水平可发挥抗癫痫效应，同时确定PSPH为抗癫痫治疗的潜在核心靶点。

体外与体内研究表明，Z218484536是具有前景的先导化合物，需进一步优化其效力、选择性及药代动力学特征，有望成为TLE的新型治疗药物。

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