文章标题：Targeting polyamine metabolism and ferroptosis enhances the efficacy of KRAS-targeted therapy depending on KEAP1 status

发表期刊：nature communications

影响因子：15.7

客户单位：复旦大学附属中山医院

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

KRAS突变在胰腺癌、结直肠癌、肺癌等癌症中高发，虽索托拉西布等KRAS靶向抑制剂已实现临床突破，但疗效常因KEAP1、LKB1等共突变显著受限。铁死亡作为一种铁依赖、以多不饱和脂肪酸过氧化为特征的细胞死亡方式，已被证实可有效克服肿瘤治疗耐药性，且KRAS突变对脂质代谢和抗氧化反应的复杂调控，为通过促进铁死亡增强KRAS靶向治疗效果提供了潜在可能，不过KEAP1突变会破坏KEAP1-NRF2抗氧化通路，可能影响铁死亡诱导效果。多胺（精胺、亚精胺等）在肿瘤细胞持续增殖中起关键作用，其分解代谢关键酶SAT1可通过催化多胺乙酰化、经PAOX氧化生成ROS进而促进铁死亡，KRAS突变肿瘤细胞常依赖高多胺水平维持增殖，靶向SAT1介导的多胺代谢已成为癌症治疗潜在方向，但该方向在KRAS靶向治疗中的应用及KEAP1状态对其的调控作用尚未得到充分研究，因此本研究旨在通过相关实验探究基于KEAP1状态的多胺代谢与铁死亡在KRAS靶向治疗中的作用及机制，为KRAS突变癌症的精准治疗提供理论支持。

研究结论

01.多胺以KEAP1依赖方式协同增强KRAS抑制剂的疗效

通过889种代谢物库筛选（图1A），发现精氨酸、鸟氨酸、亚精胺、精胺等多胺类代谢物能显著增强KRAS抑制剂（索托拉西布、阿达格拉西布）对MIAPACA2细胞的抑制作用（图1B）。在15种KRAS^G12C突变细胞系中，10种细胞表现出协同效应，5种无协同效应（图1D），结合CCLE数据库分析发现，多胺仅在 KRAS^MU/KEAP1^WT细胞系（如MIAPACA2、H1373）中增强KRAS抑制剂敏感性，在KRAS^MU/KEAP1^MU细胞系（如H23、H2122）中无此作用（图1E），且该结果在新型KRAS抑制剂(fulzerasib、garsoasib)、泛KRAS抑制剂(BI-2493)和KRAS^G12D抑制剂(MRTX1133)中均得到验证。在PAAD和LUAD患者来源类器官(patient-derived organoids, PDOs)中（图1F-G），亚精胺能显著增强KRAS抑制剂对 KRAS^MU/KEAP1^WT PDOs的抑制作用（图1H-I），但对KRAS^MU/KEAP1^MU PDOs无影响（图1J-K）。功能验证显示，敲除MIAPACA2和H1373细胞的KEAP1后，多胺的协同作用消失；在H23细胞中过表达KEAP1，则恢复多胺对KRAS抑制剂的敏感性（图2A），证实KEAP1状态是多胺发挥协同作用的关键。

图1. 多胺以KEAP1依赖的方式协同增强KRAS抑制剂的疗效

02.KEAP1^WT依赖的SAT1上调增强多胺与KRAS抑制剂的协同作用

RNA-seq分析显示，KRAS抑制剂处理后，KRAS^MU/KEAP1^WT的MIAPACA2和H1373细胞中SAT1（多胺分解代谢关键酶）显著上调，而 KRAS^MU/KEAP1^MU的H23细胞中SAT1显著下调，多胺合成关键酶ODC1在两组细胞中均下调（图2C-D）。代谢组学检测发现，KRAS抑制剂处理后，MIAPACA2和H23细胞中精胺、亚精胺及其乙酰化产物（N¹-乙酰精胺、N¹-乙酰亚精胺）水平降低，且H23细胞中乙酰化产物的降低更为显著（图2E）。SAT1-KO的MIAPACA2细胞中，多胺无法增强KRAS抑制剂的疗效；而SAT1-OE的H23细胞中，多胺显著提升药物敏感性，但酶活性位点突变的SAT1-Y140F无此作用（图2G），证实SAT1的酶活性是协同作用的核心。进一步研究显示，敲除KEAP1可抑制KRAS抑制剂诱导的SAT1上调，过表达KEAP1则可逆转H23细胞中SAT1的下调（图2H），且KEAP1突变体同样能上调SAT1表达，表明KEAP1对SAT1存在负向调控，且该调控在KRAS抑制剂处理后发生逆转。

图2. KEAP1^WT依赖的SAT1上调增强了多胺与KRAS抑制剂之间的协同作用

03.SAT1介导的多胺分解代谢通过铁死亡增强KRAS 抑制效果

在MIAPACA2细胞中，多胺与KRAS抑制剂联合处理后，铁死亡标志物MDA含量（图3B）、脂质过氧化水平（图3C）、细胞内亚铁离子浓度（图3D）显著升高，透射电镜观察到线粒体皱缩、嵴消失（图3E-F），而铁死亡抑制剂(Fer-1、DFO)可完全阻断多胺与KRAS抑制剂的协同作用，凋亡或坏死抑制剂无此效果（图3A）。SAT1-KO的MIAPACA2细胞中，联合处理未引起铁死亡标志物的显著变化；而SAT1-OE的H23细胞中，铁死亡标志物显著升高，线粒体损伤加重，但SAT1-Y140F突变体无法诱导该效应（图3H-L）。此外，多胺的补充可增加细胞内H₂O₂生成，该效应可被SAT1-KO或PAOX-KO阻断，证实SAT1介导的多胺N1-乙酰化与PAOX介导的乙酰化多胺氧化反应共同产生H₂O₂，通过芬顿反应促进铁死亡，进而增强KRAS抑制剂的细胞毒性。 

图3. SAT1介导的多胺分解通过铁死亡增强KRAS^MU/KEAP1^WT中的KRAS抑制效果

04.通过SAT1介导的多胺代谢与铁死亡克服药物耐药性

通过7个月梯度递增KRAS抑制剂浓度，成功构建MIAPACA2和H23的耐药细胞系（IC₅₀较亲本细胞升高10倍以上）（图4A-B）。在MIAPACA2耐药细胞(KRAS^MU/KEAP1^WT)中，多胺仍能显著增强KRAS抑制剂的疗效；但在H23耐药细胞(KRAS^MU/KEAP1^MU)中无协同作用（图4C）。RNA-seq和WB结果显示，耐药的MIAPACA2细胞中SAT1仍保持高表达，而耐药的H23细胞中SAT1表达进一步下调（图4E-F）。代谢组学分析发现，耐药细胞中精胺、亚精胺水平降低（与多胺合成关键酶ODC1下调一致），且H23耐药细胞中N¹-乙酰精胺和N¹-乙酰亚精胺的降低更为显著（图4G）。联合处理后，MIAPACA2耐药细胞的脂质过氧化水平显著升高（图4H），证实SAT1介导的多胺代谢与铁死亡通路可有效克服KRAS靶向治疗的耐药性。

图4. 通过SAT1介导的多胺代谢和铁死亡克服药物耐药性

05.KRAS抑制剂通过JNK/NRF2/SAT1和JNK/c-Jun/SAT1通路调控SAT1表达 

WB分析显示，KRAS抑制剂处理后，H23细胞(KRAS^MU/KEAP1^MU)中NRF2表达与SAT1同步下调，且磷酸化JNK(p-JNK)和磷酸化c-Jun(p-c-Jun)在MIAPACA2和H23细胞中均显著上调（图5A）。JNK抑制剂(JNK-IN-8、JNK-IN-11)可逆转MIAPACA2细胞中SAT1的上调，同时阻止H23细胞中NRF2的降解和后续SAT1的下调，而NF-κB抑制剂无此效果（图5B）。ChIP-qPCR和DNA pull-down实验证实，NRF2和c-Jun均能结合到SAT1的启动子区域（图5C-D）；双荧光素酶报告基因实验显示，KRAS抑制剂可增强MIAPACA2细胞中SAT1的转录活性（依赖c-Jun结合位点），抑制H23细胞中SAT1的转录活性（依赖NRF2结合位点）（图5F）。免疫荧光染色进一步验证，MIAPACA2细胞中KRAS抑制剂促进c-Jun与SAT1启动子结合，而H23细胞中则促进NRF2降解，进而抑制SAT1表达（图5G-H），表明KRAS抑制剂根据 KEAP1 状态，通过JNK/c-Jun/SAT1(KEAP1^WT)或JNK/NRF2/SAT1(KEAP1^MU)双通路特异性调控SAT1转录。

图5. KRAS抑制剂通过JNK/NRF2/SAT1和JNK/c-Jun/SAT1通路调节SAT1表达

06.靶向SAT1介导的多胺代谢在体内模型中增强KRAS抑制剂的疗效

在KRAS^MU/KEAP1^WT的PAAD和LUAD PDOs中，多胺的补充可增加MDA含量，增强KRAS抑制剂的疗效，该效应被SAT1-KO阻断；在KRAS^MU/KEAP1^MU的PAAD和LUAD PDOs中，仅当SAT1-OE时，多胺才能显著提升药物敏感性（图6C-D）。异种移植模型中，MIAPACA2细胞移植裸鼠经精胺与索托拉西布联合治疗后，肿瘤体积和重量显著小于药物单药组（图6F-H）；H23细胞移植裸鼠经AAV介导SAT1过表达后，联合治疗显著抑制肿瘤生长（图6I-K）。在KRAS^G12C突变自发性肺癌小鼠模型中（图6L），联合治疗组的肿瘤经CT扫描显示几乎完全消失，小鼠生存期显著延长（图6M-N），证实靶向SAT1介导的多胺代谢在体内可有效增强KRAS靶向治疗的疗效。

图6. 精确靶向SAT1介导的多胺代谢以增强PDOs、异种移植和自发性肺癌小鼠模型中的KRAS抑制剂效果

研究总结

本研究通过代谢物库筛选、细胞实验、体内模型验证及机制探究，明确多胺可通过SAT1介导的多胺分解代谢促进铁死亡，进而增强KRAS靶向治疗的疗效，且该效应依赖KEAP1状态。具体机制为：在KRAS^MU/KEAP1^WT肿瘤中，KRAS抑制剂激活JNK/c-Jun通路，促进SAT1转录；多胺补充后，SAT1催化精胺、亚精胺乙酰化，经PAOX氧化生成H₂O₂，通过芬顿反应诱导铁死亡，增强药物敏感性；在KRAS^MU/KEAP1^MU肿瘤中，KRAS抑制剂激活的JNK通路促进NRF2降解，导致SAT1表达下调，需先通过慢病毒或AAV介导SAT1过表达，多胺才能发挥铁死亡诱导和药物增敏作用。该研究还证实，靶向SAT1介导的多胺代谢可有效克服KRAS靶向治疗的耐药性，在患者来源类器官、异种移植模型和自发性肺癌小鼠模型中均展现出显著的治疗效果。综上，本研究揭示了KEAP1状态对多胺代谢与KRAS靶向治疗协同作用的调控机制，提出以SAT1为核心的精准治疗策略，为KRAS突变癌症（尤其是伴KEAP1共突变的患者）提供了新的治疗方向和实验依据。

图7. 针对SAT1介导的多胺代谢和铁死亡，以增强不同KEAP1状态下KRAS突变癌症的靶向治疗效果