文章标题：Extended coverage of human serum glycosphingolipidome by 4D-RP-LC TIMS-PASEF unravels association with Parkinson’s disease

发表期刊：nature communications

影响因子：15.7

研究背景

糖鞘脂(Glycosphingolipids, GSLs)作为细胞膜关键组分，参与细胞识别、信号传导等核心生理过程，其结构与表达异常和免疫疾病、感染性疾病、溶酶体贮积病、癌症及帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)等神经退行性疾病密切相关，是疾病机制研究与生物标志物发掘的重要靶点。

然而，传统分析技术受限于GSLs的高度结构多样性、低丰度、异构体分离难度及定量策略缺失，存在通量不足、覆盖度浅、数据库支撑不足等问题，难以实现临床样本中糖鞘脂组的系统解析，无法全面揭示其与疾病的关联。在此背景下，开发高灵敏度、高覆盖度、高通量且能精准区分异构体的糖鞘脂组学分析平台成为关键需求。

本研究引入4D-RP-LC TIMS-PASEF MS技术，通过整合反相液相色谱(RP-LC)、捕获离子淌度谱(TIMS)与平行累积连续碎裂质谱(PASEF)，以质荷比(m/z)、保留时间(RT)、碰撞截面(CCS)、MS/MS质谱为四维特征，实现中性GSLs、唾液酸化GSLs及硫脂的全面覆盖，突破传统技术瓶颈，为深入解析糖鞘脂组与PD的关联提供全新技术支撑。

研究结果

01.4D-RP-LC TIMS-PASEF糖鞘脂组学平台的分离策略与方法优化

首先，针对传统聚糖基分离技术（如HILIC/正相色谱）中存在的同位素体重叠问题（相似聚糖结构但不同神经酰胺链的GSLs共洗脱），本研究尝试以RP-LC基于神经酰胺疏水性分离GSLs。经方法优化后发现，“关闭在线校准、开启TIMS” 能有效提升电离效率与检测灵敏度。结果显示，不同GSLs生成特征离子（如GM3/GM2为[M−H]⁻，GD/GT/GQ为[M−2H]⁻，GP为[M−H₂O−2H]²⁻），RP-LC依据神经酰胺结构（链长、饱和度、羟基化）及糖基化/唾液酸化修饰程度实现有效分离（图1b）；TIMS可在正负离子模式下对GD1a/GD1b异构体完成部分分离（图1c），与RP-LC的色谱分离形成正交互补；二者结合的RP-LC-TIMS-PASEF碎裂技术（正离子模式解析神经酰胺组成，负离子模式解析聚糖结构）能精准匹配神经酰胺组成与聚糖结构。

图1. 利用RP-LC TIMS-PASEF开展的四维糖鞘脂组学分析

此外，各糖鞘脂亚类在m/z-RT-CCS三维空间（图1d）和m/z-CCS二维维度（图1e）中形成专属区域，实现近乎基线的区分，这既解决了同位素体重叠的定量难题，也为未知GSLs的从头鉴定奠定基础。更惊喜的是，在定制的标准品中还鉴定出Fuc-GD1、GalNAc-GD1等新亚型（图1c, 图2a-c），并在猪脑提取物中鉴定出47种分属17个亚类的神经节苷脂（图2d），为该样本中已报道的最高鉴定数量。以上结果证实，4D-RP-LC-TIMS-PASEF对中长链、高唾液酸化，以及岩藻糖基化、O-乙酰化修饰的糖鞘脂，具备优异的高灵敏度检测和高分辨率分析能力，为后续复杂生物样本的糖鞘脂组学分析筑牢技术基础。

图2. 标准品与猪脑提取物中O-乙酰化/岩藻糖基化/五唾液酸化糖鞘脂的代表性PASEF谱图

02.4D糖鞘脂数据库的构建及自动化注释应用

当前，GSLs结构表征存在着数据库缺陷的核心难题：注释数据库缺乏实验碎裂光谱，复杂修饰型GSLs（如岩藻糖基化、O-乙酰化修饰GSLs及五唾液酸神经节苷脂GP等）无虚拟碎裂数据支撑，且现有数据库仅含简单GSLs亚型，数据为虚拟模拟生成，缺失生物基质和溶剂效应信息，无法实现生物样本中高可信度的GSLs注释与中高通量分析。

为解决这一问题，研究基于商用标准品和猪脑提取物，构建了首个基于4D-RP-LC TIMS-PASEF技术的、包含保留时间(RT)、碰撞截面积(CCS)、质荷比(m/z)及PASEF质谱的四维(4D)实验数据库。该数据库共收录226种神经节苷脂，命名为“4D-sialoGSL standards library”，通过关联多维度参数形成分析物列表，为血清GSLs注释提供核心依据。

03.人血清中糖鞘脂的微量提取

研究前期开发的血清GSLs提取方法虽然能从300 µL血清中提取中长链唾液酸化GSLs，但需依赖nanoflow HPLC/nanoESI-QTOF MS的灵敏分析，且长链物种主要在合并提取物中才能检出。为匹配4D-TIMS-PASEF平台的高通量和高灵敏度，本研究对此方法进行了系统性优化。

优化后的提取流程包括：磷酸甘油酯去除、反相纯化，以及关键的硅胶分级步骤（图3a）。其中，原方法的 “四步” 硅胶分级被简化为 “两步”，分别富集组分1（中性GSLs、硫脂、GM3）和组分2（复杂唾液酸化GSLs）。相比 “四流程法”（135种），“两流程法” 能够检测到更多复杂的GSLs（147种，图3b），同时也显著缩短了样品处理、分析与数据处理时间，降低了半定量的变异性，并减少了样品损失。

此外，简化分级的另一重要考量是内标的跨组分分散问题。由于GSLs（尤其GT、GQ等类别）的氘代内标极为匮乏，必须使用跨类内标。然而，原多步分级易导致内标分散于不同组分，干扰半定量。对此，本研究评估了四种内标(GD3-d3、GM1-d5、GM2-d9、GM3-d5)在两组分间的分配比例（图3c）。结果显示，其在组分2中的分配比例稳定且重现性良好（四种内标占比70.35%-80.40%，CV均低于7.5%），验证了优化方法的有效性，为后续血清GSLs半定量奠定了基础。

图3. 微量提取人血清中的GSLs

04.人血清糖鞘脂组

为验证GSLs微提取与4D糖鞘脂组学联用体系的分析性能，本研究对NIST 1951c标准血清及志愿者血清进行了分析。结果显示，所建立的血清GSLs提取方法（图3a）结合µL-flow RP-LC-TIMS-PASEF技术，在唾液酸化GSLs结构异质性覆盖方面显著优于传统nanoflow LC-MS（图3d）。这一提升主要得益于两步分馏策略（图3b）及RP-LC与TIMS联用带来的结构分辨能力增强。TIMS能有效分离RP-LC无法区分的同分异构体（如GM1与Neu5Ac-nLc4Cer），结合PASEF碎裂谱实现明确结构解析（图4a），充分体现离子迁移与液相色谱的正交分离优势。

在血清组分2中，共鉴定出159种唾液酸化GSLs，覆盖20个亚类，创人血清中唾液酸化神经节与新乳糖系列鉴定数量新高。负离子模式下PASEF保留高唾液酸化结构并清晰解析糖链构型（图4b-c）；正离子模式则可明确神经酰胺脂肪酰链与鞘氨醇碱基类型。在组分1中，145种中性GSLs与72种硫苷脂被鉴定（图5），PASEF同样可准确推导其糖链与神经酰胺结构（图4d-e）。

图4. 人血清中GSLs的代表性PASEF质谱图

此外，该平台还成功检出Fuc-GD1、O-acetyl GD1、GQ1b等低丰度及高修饰GSLs，实现nLc4-nLc12长链新乳糖系列与人血清硫苷脂的广泛覆盖。RP-LC与IMS的互补分离在三类GSLs中表现明显：IMS区分糖链构型，RP-LC分辨神经酰胺组成（图5）。同时，该平台通量较高，24样本可在2.5天内完成全流程分析。基于鉴定结果，研究还构建了首个4D-TIMS-PASEF糖鞘脂组综合实验质谱库，以及血清唾液酸化、中性GSLs及硫苷脂三个4D数据库，为各类样本中GSLs的自动化、高可信度注释提供重要支撑。

图5. 基于µL-flow 4D-RP-LC-TIMS-PASEF技术鉴定的人血清GSLs组

05.人血清中唾液酸化GSLs的半定量策略

为实现单个血清样本中唾液酸化GSLs的可重现半定量，本研究针对内标匮乏、跨组分分配及数据处理难题，设计了两种定量策略（图6a）。其中，策略I基于对照血清中内标的平均分配系数（6次提取）计算样本含量；策略II则使用每个样本内标的实际分配系数，但需分析两个组分，增加耗时。除此之外，两种策略结合三种内标组合的 “子策略”（图6b）也一并被评估，采用35%变异系数(CV)为阈值。

结果显示，策略I初始CV<35%的物种比例较低，主要因两个离群样本的内标分配异常。排除1个离群值后，比例提升至67.21%-76.23%；排除2个离群值后进一步提升至84.42%-87.80%。策略II在未排除离群值时，CV<35%物种比例已达66.39%-70.49%，整体优于基于平均分配的策略I，但需分析两组分。三种内标组合中，“子策略三” 结果最稳定、离群值最少，表明待测物与内标行为一致。

综合考量，推荐采用 “子策略三结合策略II”，离群样本可用策略I校正。校正后，72.95%的物种CV<35%，多数亚类平均CV低于 30%（图6c）。方法学验证显示，主要GSL亚类线性R²>0.97，检测限(LLOD)达低fmol级，定量限(LLOQ)为高fmol 级。GD1的LLOQ最高，可能因其GD1a/GD1b异构体共存（图6d）。平均残留效应仅1.2%。组分1中性GSLs和硫苷脂的半定量采用内标GM3 18:1;O2/18:0-d5的峰面积归一化。

图6. 人血清中唾液酸化GSLs的定量策略

06.帕金森病中GSLs的表达变化

帕金森病以α突触核蛋白聚集为典型特征，GBA1突变及GCase活性降低是重要危险因素，但既往研究缺乏GSLs分子层面的系统解析。研究对30例健康对照与28例PD患者血清进行GSLs分析，共鉴定出98种唾液酸化GSLs、145种中性GSLs及72种硫苷脂，分子覆盖C10-C24脂肪酰链及多种神经酰胺结构类型。以性别和年龄为协变量的统计分析显示，PD组共有41种GSLs显著上调，主要包括39种神经节系列（GM3、GM2、GD3、GD1等）以及2种唾液酸化新乳糖系列(nLc4、nLc6)，表明相关糖基转移酶通路出现异常活化（图7a-b）。

图7. 帕金森病中唾液酸化糖鞘脂的表达特征

进一步分析发现，PD患者GSLs表达存在显著性别差异，多种GM3亚型、GD1系列及新乳糖系列分子在男女患者间呈相反变化趋势（如女性GT1b、部分GM3 亚型升高，男性GD1系列升高，O-acetyl GD1呈反向改变），与临床中男女PD易感性及病程进展差异相吻合，证实本方法可稳定反映临床表型（图8a-b）。HexCer水平无明显改变，与受试患者未携带GBA1突变相一致；下游延伸中性GSLs(Hex2Cer、Hex3Cer、HexNAcHex3Cer)显著上调，变化趋势与唾液酸化GSLs一致。硫苷脂亚类整体无显著差异，仅部分SHexCer分子水平存在改变（图8c-d）。

综上所述，本研究系统揭示了PD相关的GSLs异常谱，为PD生物标志物筛选及病理机制研究提供重要依据。

图8. 健康对照组与帕金森病组的糖鞘脂差异定量特征

研究总结

本研究搭建的4D-RP-LC-TIMS-PASEF技术平台，搭配专属4D数据库实现了糖鞘脂(GSLs)的自动化高可信度注释，为临床脂质组学研究提供了强力支撑。依托该平台，成功在人血清中鉴定出376种GSLs（159种唾液酸化GSLs、145种中性GSLs及72种硫脂），大幅拓展了复杂脂质的覆盖范围。在帕金森病(PD)临床应用中，该平台展现出卓越价值：锁定41种在PD患者中显著上调的GSLs，同时发现14种存在性别差异的GSLs，清晰揭示了PD相关的GSLs异常谱及潜在代谢通路。这一成果不仅为PD生物标志物筛选与病理机制研究开辟新路径，更充分印证了4D脂质组学技术在神经退行性疾病及多类疾病研究中的广阔应用前景，为临床转化研究提供了有力支撑。