英文标题：Spatial metabolomics revealed mTOR-mediated gastric epithelial repair by licorice (G. inflata) flavonoids

中文标题：空间代谢组学揭示胀果甘草黄酮通过mTOR介导调控胃上皮修复

发表期刊：Food Research International

影响因子：8.0

研究背景

过量饮酒是诱发胃溃疡的重要危险因素，高浓度酒精会破坏胃黏膜屏障，引发氧化应激与炎症浸润，抑制上皮修复。胃黏膜修复是高度依赖ATP的能量代谢过程，糖酵解、三羧酸循环及线粒体功能紊乱会阻碍损伤愈合。

甘草(Glycyrrhiza inflata)作为我国经典药食同源中药材，其活性组分甘草黄酮(Licorice flavonoid, LF)已被证实具有抗炎、抗氧化及胃黏膜保护作用。现有研究表明，LF可通过PI3K/AKT通路抑制细胞凋亡、经EGFR/ERK通路促进黏膜再生，对酒精性胃溃疡具有显著改善效果。但LF生物利用度较低，其在胃组织局部如何调控代谢网络、驱动黏膜修复的分子机制尚未系统阐明。

mTOR通路作为细胞能量感应与代谢调控核心节点，可感知营养与能量状态，调控细胞增殖、迁移及能量代谢，在胃黏膜损伤修复中发挥关键作用。鉴于传统代谢组学难以揭示组织层面代谢物空间分布特征，本研究整合非靶标代谢组学与MALDI-MSI空间代谢组学技术，用以探究LF改善酒精性胃黏膜损伤的代谢调控机制。

技术路线

研究结论

01.胃溃疡大鼠中LF的药代动力学特征

首先，研究建立了可同步定量大鼠血浆中5种LF活性成分(LCB、LG、ILG、LFA、LCA)的高灵敏度LC-MS/MS检测方法。经验证，此方法空白血浆对目标分析物无显著基质干扰（图1A-C），各项指标及结果正常稳定。基于该方法，5种成分的血浆浓度-时间变化曲线（图1D-H）被绘制，经DAS软件计算获得胃溃疡大鼠的主要药代动力学参数（表1）。结果表明，LF口服后吸收迅速，5种成分达峰时间(Tmax)为0.395~1.445h，其中LG吸收最快，LCA吸收最慢；成分消除半衰期(T1/2z)为7.688~16.215h，表明LF在体内消除缓慢，具备长效作用潜力。其中，LCA的Cmax、AUC均最高，为最主要吸收入血成分，其余4种成分口服生物利用度相对较低。此外，胃组织检测证实，LCA、LG、ILG可在胃组织稳定检出，表明其兼具血液吸收与胃黏膜亲和性，可通过胃部局部滞留直接发挥抗溃疡活性。简言之，LF经口服后可快速到达胃黏膜，消除缓慢，其中LCA是血浆中主要的暴露成分，而多种成分通过黏膜亲和性实现局部滞留，有利于后续的胃黏膜保护及修复。

图1.LCB、LG、ILG、LFA、LCA的提取总离子流图与血浆浓度—时间曲线

表1.胃溃疡模型大鼠灌胃给予LF后5种成分的药代动力学参数

02.LF对胃溃疡大鼠胃黏膜损伤及胃酸分泌的改善作用

通过肉眼观察和组织病理学评估，研究明确了LF对酒精诱导的胃溃疡大鼠胃黏膜损伤的改善作用，结果如下：

①宏观形态学观察显示，酒精灌胃可造成大鼠胃黏膜结构破损、表面粗糙，伴点状/线状出血、多发糜烂溃疡及水肿；但经LF干预后，大鼠胃溃疡指数显著降低，仅见散在的点状糜烂和少量出血（图2A-B），其中低、高剂量LF组的溃疡抑制率分别达52.8%、77.8%，量效关系明确。

②组织病理学检测证实，LF与阳性对照药奥美拉唑(OME)均可显著减轻胃组织出血性病变、黏膜溃疡、炎症浸润与水肿，同时促进胃上皮修复，维持胃腺体结构完整（图2C-D）。

③分子水平检测发现，酒精可显著上调胃酸分泌关键效应分子ATP4α、CCKBR的mRNA表达，诱导胃酸过度分泌；而LF可显著逆转该异常变化，表明LF可通过调控上述靶基因表达，抑制病理性胃酸分泌，发挥胃黏膜保护作用（图2E-F）。综合而言，LF显著减轻了酒精引起的胃黏膜损伤，促进上皮修复，并抑制胃酸分泌，表现出良好的抗胃溃疡作用。

图2.LF干预对胃溃疡的改善、氧化应激的抑制及炎症浸润的缓解作用

03.LF减轻胃溃疡大鼠的氧化应激与炎症浸润

氧化应激与炎症反应是酒精性胃黏膜损伤的核心病理机制。抗氧化酶作为机体第一道防线，对维持抗氧化能力至关重要。经检测，酒精暴露可显著下调大鼠胃组织中CAT、GSR、GPX、NQO1、SOD1、SOD2共6种关键抗氧化酶的表达，破坏机体抗氧化防御体系；而LF干预可显著逆转上述酶活性的下降，增强胃黏膜抗氧化能力，促进溃疡修复（图2G-L）。在炎症浸润方面，酒精可诱导胃黏膜及黏膜下层大量巨噬细胞浸润，LF（尤其高剂量组）可显著抑制该效应（图2M-N）；同时，LF还逆转了酒精诱导的炎症趋化因子MCP-1（黏膜下层）与黏附分子ICAM-1（黏膜）的表达上调（图2M-P），进一步减轻炎症细胞的募集与浸润。因此，LF可通过增强胃黏膜抗氧化能力、抑制炎症细胞浸润，发挥胃黏膜保护作用。

04.LF改善酒精诱导的代谢紊乱

为探究LF对胃溃疡(GU)大鼠体内代谢物的调控作用，研究进一步采用UPLC-Orbitrap-MS进行代谢组学分析。总离子流图显示，各组代谢物轮廓存在显著差异（图3A），LF治疗调节了酒精导致的代谢物紊乱。主成分分析显示，质控样本(QC)聚集良好（图3B-C），表明数据稳定性高；同时，LF高剂量组与正常对照组(NC)更接近，而与GU组显著分离，初步说明LF可改善代谢扰动。OPLS-DA进一步验证了组间代谢差异：GU组与NC组（图3D,F）、LF高剂量组与GU组（图3H,J）的代谢谱均明显区分；200次置换检验结果证实所有模型均无过拟合问题（图3E,G,I,K），数据分析结果可靠，能够准确反映LF对胃溃疡大鼠代谢的调控效应。综上，代谢组学数据揭示了LF通过调节代谢紊乱发挥治疗作用；同时，LF可能通过多靶点代谢调控改善酒精诱导的胃黏膜损伤，具有潜在的临床应用价值。

图3.基于尿液样本的代谢组学多元统计分析

05.LF干预下的代谢通路与生物标志物分析

根据不同VIP值与p值标准，总计81个显著差异代谢物(SDEMs)在正常组(NC)、胃溃疡组(GU)和高剂量甘草黄酮组(LFH)中被鉴定，其中正离子模式36个、负离子模式45个。在NC与GU组差异代谢物(DEMs)的通路富集中，共计15条核心通路影响值>0.1，其中包括核黄素代谢、谷胱甘肽代谢、苯丙氨酸代谢、维生素B6代谢等（图4A）。与GU组相比，LFH组共有33个DEMs可被LF成功逆转（图4B）。具体而言，LF可上调核黄素、生物素、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸、吡哆醇及辅酶A的水平，下调吡哆胺含量。这些代谢物主要参与糖酵解、三羧酸循环等能量代谢过程，为黏膜修复提供能量支持。为进一步明确其在胃黏膜不同分层的原位作用机制，本研究后续开展了MALDI-MSI分析。

图4.代谢通路与生物标志物多元统计分析

06.基于MALDI-MSI验证胃溃疡代谢标志物及LF的调控作用

06.1-代谢差异主要存在于胃壁各层，而非全胃组织

在MALDI-MSI技术的加持下，研究首先对全胃组织切片进行了差异代谢物分析。依据前期预设筛选条件，通过将胃壁划分为黏膜层(M)、黏膜下层(SM)和肌层(MC)后，组间代谢差异得以显现（图5A-C）。结果而言，黏膜层是胃溃疡发生与修复的核心部位。正常组(NC)与溃疡组(GU)在该层的代谢物差异最为显著（图5A）。当溃疡发生时，辅酶A、花生四烯酸、AMP、ADP等关键代谢物水平显著降低。进一步对黏膜层进行KEGG富集分析（图5D、E），可以明确，酒精诱导的胃溃疡可显著干扰PI3K-Akt、mTOR、FoxO等信号通路；且经LFH干预后，差异代谢物亦同样富集于上述通路，与该团队前期研究结果一致。

图5.胃不同组织层SDEMs及KEGG富集分析

06.2-胃溃疡所致核酸代谢紊乱及LF的修复作用

胃肠道黏膜损伤后的快速上皮再生是高度依赖ATP的能量代谢过程。通过MALDI-MSI技术，研究发现，与核酸代谢相关的ATP、GDP、GTP、AMP、ADP等多种代谢物在胃溃疡大鼠胃壁不同层次中发生了显著变化。具体而言，在胃黏膜层中，胃溃疡组(GU)核酸代谢物水平较正常组显著降低；但经LF干预后，ATP、GTP、GDP水平显著回升，ADP、AMP亦呈轻度上调趋势（图6A–E）。此外，肌层中GTP变化趋势与黏膜层基本一致；而黏膜下层中ADP、AMP、GDP在LF干预后未见明显改变。简单来说，LF可特异性上调胃黏膜层核酸代谢相关物质水平，提升了ATP合成能力，为黏膜修复提供充足能量供给。

图6.基于MALDI-MSI的胃溃疡能量代谢紊乱及LF的干预作用

06.3-胃溃疡引发糖酵解与TCA循环紊乱及LF的调控作用

胃肠道黏膜正常生理功能与损伤修复的能量供应，主要依赖糖酵解与TCA循环通路协同维持。经MALDI-MSI检测，在胃黏膜内仅果糖-6-磷酸(F-6-P)和果糖-1,6-二磷酸(F-1,6-P)显示出明显的质谱信号（图6F-G）。与GU组相比，LFH组黏膜层中的F-6-P和F-1,6-P含量均显著升高；其中F-1,6-P在肌层中也出现升高。在TCA循环体系中，辅酶A、异柠檬酸、苹果酸及草酰乙酸等核心代谢物被检测。酒精损伤可显著降低胃黏膜层辅酶A表达，而LF可有效逆转该异常，并改善黏膜下层与肌层的辅酶A代谢失衡（图6H）。同时，LFH处理显著提升了黏膜层与肌层异柠檬酸水平（图6I）。由此可见，酒精可在胃黏膜层、黏膜下层及肌层多部位诱发糖酵解与TCA循环紊乱，且病变以黏膜层最为显著。LF可通过靶向调控能量代谢关键代谢物，有效修复胃组织能量代谢障碍，进而改善胃黏膜损伤（图6J）。

07.LF调控胃黏膜能量代谢与线粒体动态以促进损伤修复

糖酵解、三羧酸循环及线粒体功能是胃肠道能量供应的核心环节。在胃溃疡模型组中，葡萄糖与ATP含量显著降低，能量合成受阻（图7A-B）；而经不同剂量LF干预后，二者水平均显著回升。同样地，胃黏膜损伤也下调了葡萄糖转运蛋白GLUT1表达，但亦会被LF所逆转，细胞对葡萄糖的摄取能力得以加强（图7C、H）。在能量代谢关键酶方面，LF显著提高了糖酵解通路及TCA循环相关基因表达，有效逆转酒精所致的酶活性抑制，全面激活能量代谢通路（图7F-G）。线粒体稳态检测显示，LF干预可恢复线粒体外膜标志蛋白TOMM20表达，回调线粒体质量控制及动力学相关基因水平，改善线粒体结构与功能异常（图7C、H、I）。综上所述，LF可通过提升葡萄糖摄入、促进ATP生成、激活糖酵解与三羧酸循环、修复线粒体稳态，为胃黏膜修复再生提供充足能量，从而发挥抗胃溃疡作用。

图7.LF对能量代谢相关分子及线粒体动力学的促进作用

08.LF通过激活mTOR与糖酵解通路促进胃黏膜修复再生

EGF、TGF-α、HGF、IGH等生长因子是调控胃黏膜上皮增殖、迁移与再上皮化的关键分子，可通过激活mTOR通路介导代谢、运动与细胞增殖。与正常组相比，胃溃疡组的相关生长因子表达显著下调，而低、高剂量LF均可显著上调其表达（图8A-D）。类似地，模型组p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1、Hif-1α表达也显著受抑，但可被LF所激活（图8E-I）。此外，胃溃疡组胃黏膜（尤其黏膜表层）p-mTOR与HK2表达显著降低；LF干预后二者表达同步明显回升（图8J）；同时，LF显著上调糖酵解关键限速酶HK2、PFKM、PKM2、LDHA的表达（图8K-O）。整体而言，LF可通过上调生长因子表达，协同激活mTOR信号通路与下游糖酵解通路，强化能量代谢供给，进而促进胃黏膜损伤修复与再生。

图8.LF通过激活mTOR与糖酵解通路发挥胃黏膜修复及再生作用

09.维生素B族代谢物提升ATP水平并激活mTOR信号通路

基于前期血清与尿液代谢组学结果，可以明确，LF干预可共同富集7条代谢通路，其中烟酸与烟酰胺（维生素B3）代谢通路差异显著（图9A）。与胃溃疡模型组相比，LF可显著上调该通路关键代谢物烟酰胺、1-甲基烟酰胺的表达（图9B）。以人胃黏膜GES-1细胞开展体外验证，酒精刺激会造成细胞损伤，降低ATP水平，并抑制mTOR通路关键蛋白p-mTOR、p-p70S6K及p-4EBP1的活化。而维生素B3预处理则能有效逆转上述异常，缓解能量代谢障碍，明显恢复mTOR通路活性（图9D-G）。综上，维生素B3是LF调控的重要功能性代谢物质，能够提升细胞ATP合成、激活mTOR信号，与LF作用模式一致。

图9.B族维生素相关代谢物可提高ATP含量并激活mTOR通路

研究总结

本研究采用非靶标代谢组学与空间代谢组学(MALDI-MSI)联合策略，系统阐释甘草黄酮(LF)改善酒精性胃溃疡的分子机制。结果表明，LF口服吸收快、消除慢，可通过胃黏膜亲和性局部富集；能显著减轻胃黏膜损伤、抑制胃酸过度分泌、增强抗氧化酶活性并缓解炎症浸润。代谢组学证实LF可逆转酒精所致B族维生素、糖酵解、TCA循环及核酸代谢紊乱；结合空间代谢组，进一步证实LF主要在胃黏膜层修复能量代谢障碍，提升ATP生成。机制上，LF通过上调EGF、TGF-α等生长因子激活mTOR通路，促进糖酵解关键酶表达，并改善线粒体生物发生与动力学平衡；体外验证明确维生素B3可模拟LF作用，提升ATP水平并激活mTOR。综上，LF通过调控“能量代谢—激活mTOR—修复胃黏膜上皮”的级联效应发挥抗溃疡作用，为其功能产品开发提供科学依据。