英文标题：MCT1-governed pyruvate metabolism is essential for antibody class-switch recombination through H3K27 acetylation

中文标题：MCT1控制的丙酮酸代谢对于通过H3K27乙酰化进行的抗体类别转换重组至关重要

发表期刊：nature communications

影响因子：15.7

研究背景

免疫细胞的激活需要伴随代谢重编程，以满足其快速增殖和功能发挥所需的生物能量与合成需求。作为细胞能量的主要来源，葡萄糖通过糖酵解生成丙酮酸，在氧气充足时，丙酮酸进入线粒体参与三羧酸循环生成乙酰辅酶A；在低氧条件下，则通过乳酸脱氢酶转化为乳酸（Warburg效应）。然而，乳酸的积累需通过单羧酸转运蛋白(Monocarboxylate transporter,  MCT)排出胞外，以维持糖酵解的持续进行。MCTs属于溶质载体转运蛋白家族，在免疫细胞的发育、稳态、分化及激活中起关键作用，其功能失调与多种免疫疾病密切相关，如痛风、哮喘、阿尔茨海默病等。

MCT1负责转运乳酸和丙酮酸等关键代谢物。已有研究表明，MCT1缺陷会削弱活化CD8⁺T细胞的增殖与代谢，但其在B细胞中的具体功能仍不明晰。B细胞在疫苗接种后，通过抗原诱导的B细胞受体(BCR)信号或BAFF受体信号，依赖PI3K-AKT和PKC-β通路激活糖酵解并快速增殖，同时上调葡萄糖转运蛋白GLUT1和氧化代谢。在激活的B细胞中，部分细胞会经历抗体类别转换重组(Class-switch recombination, CSR)，生成免疫球蛋白G(IgG)抗体，这一过程依赖B细胞特异性的激活诱导性胞苷脱氨酶（Activation-induced cytidine deaminase，AID或AICDA）的绝对不可或缺性。尽管NF-κB信号通路、转录因子、细胞因子及组蛋白修饰等因素已被证实参与CSR中AID表达的上调，但MCT1驱动的代谢调控与CSR及抗体生产之间的功能关联尚未被揭示。

研究结果

1、MCT1转运蛋白是CSR所必需的

根据研究前期的PCR定量分析与ImmGen数据库的结果，单羧酸转运家族中的Mct1被作为本研究的重点对象。为评估MCT1及单羧酸信号在B细胞活化与功能中的作用，B细胞特异性Mct1缺陷小鼠（Mct1^f/f Mb1^Cre）被构建。

用T细胞依赖性抗原NP³³-KLH免疫后，B细胞Mct1缺失小鼠的NP特异性IgG抗体产生显著受损，而IgM抗体未受影响（图1a-c）；并且，Mct1缺陷小鼠产生的NP特异性IgG抗体对抗原的亲和力较弱（图 1d）。当使用T细胞非依赖性抗原NP-Ficoll免疫后，Mct1缺失主要导致IgG3抗体产量减少，而IgM水平不变。以上结果表明，Mct1缺陷特异性破坏IgG抗体应答，由此推测，受损的CSR伴随生发中心反应的改变可能导致IgG抗体的减少。

为了验证上述观点，绵羊红细胞(SRBC)免疫小鼠中的生发中心B细胞(GCBC)被监测。值得注意的是，Mct1的缺失导致GCBC的分化减少（图1e-f）；与Mb1^Cre小鼠相比，Mct1^f/fMb1^Cre小鼠的GCBC数量和大小显著减少（图1g，左）；在GC区中，Ki67阳性的GCBC也显著减少（图1g，右）；IgG1阳性但非IgM阳性的B细胞比例在Mct1缺失后显著减少（图1h-i）。进一步验证，在体外，脂多糖(LPS)和白细胞介素-4(IL-4)驱动的B细胞CSR方案被应用后，Mct1缺失导致IgG1阳性B细胞的比例显著降低（图1j-l）；此外，当广谱或是特异性MCT1抑制剂分别被用作处理时，LPS和IL-4刺激的CSR反应受到抑制（图1m-o）。因此，MCT1转运蛋白对于CSR至关重要。

图1. B细胞中缺乏Mct1会抑制CSR

2、Mct1缺陷的B细胞糖酵解受到严重抑制

已知，在爆发性增殖和CSR事件中，B细胞的糖酵解非常活跃。然而，Mct1缺陷的B细胞中糖酵解效率显著降低（图2a）；并且，Mct1缺陷会抑制糖酵解关键酶——己糖激酶2(HK2)表达的上调，且不受葡萄糖的剂量的影响（图2b）；此外，作为糖酵解限速步骤的己糖激酶(HK)，其活性在Mct1缺陷的B细胞中也受到抑制（图2c）。由于乳酸和丙酮酸既是糖酵解的中间产物，也是MCT1转运蛋白的底物，所以上述现象可能是因为乳酸在B细胞内积累所致。然而，Mct1缺陷的B细胞胞内的乳酸水平并未增加，而培养上清中的乳酸水平反而显著降低（图2d-e）；重要的是，在同一批B细胞中，胞内和胞外的丙酮酸水平均显著降低（图2f-g）。基于以上结果，MCT1的缺失导致B细胞的糖酵解过程受到严重的抑制，但其机制还仍需进一步探究。

图2. Mct1缺陷抑制了B细胞的糖酵解代谢

3、Mct1缺陷B细胞的葡萄糖代谢从糖酵解转移到OXPHOS

为了探究乳酸和丙酮酸在Mct1缺陷B细胞中的代谢路程，葡萄糖同位素示踪法被应用于CSR的B细胞中（图3a-b）。有趣的是，在所有三个时间点（30、60和180分钟），Mct1缺陷的B细胞中的乳酸和丙酮酸在胞质中均出现了瞬时积累（图3c-d）；同时，柠檬酸、琥珀酸和苹果酸水平显著增加（图3e）。因此，积累的乳酸和丙酮酸可能被重新导向了TCA循环以进行氧化磷酸化(OXPHOS)。值得注意的是，Mct1缺陷B细胞中的基础耗氧率(OCR)显著增加（图3f），但ATP水平仍与对照组相似（图3g）。结合细胞增殖和凋亡情况，可知MCT1转运蛋白并未影响B细胞的存活。

目前研究表明，线粒体融合有利于OXPHOS。当线粒体变化被检测时，在B细胞胞质中，Mb1^Cre小鼠的线粒体呈小而圆的形态，而Mct1缺陷则呈管状分布（图3h）。进一步观测，缺陷型中还包含拉长的线粒体。此外，与线粒体融合一致，线粒体膜融合中介蛋白（Mfn1，Mfn2和Opa1）在Mct1缺陷B细胞中的mRNA和蛋白水平上均被上调（图3i）。

综上所述，MCT1的缺失最初导致乳酸在B细胞胞质中过量积累，这随后抑制了糖酵解，并促使乳酸重新转化为丙酮酸；然后，这些丙酮酸被重新导向线粒体丙酮酸氧化，最终导致代谢通路从糖酵解转向线粒体丙酮酸氧化。这种代谢通路的重编程使得Mct1缺陷B细胞能够维持能量稳态，这对于它们的存活和功能至关重要（图3j）。

图3. Mct1缺陷促进葡萄糖流入线粒体丙酮酸氧化

4、丙酮酸与MCT1转运蛋白在功能上偶联以调节AID的表达

AID在CSR中起着至关重要的作用。对比Mb1^Cre小鼠和Mct1^f/fMb1^Cre小鼠，在Mct1缺陷的B细胞中，其AID的表达显著降低（图4a）；同样地，在mRNA和蛋白水平上，AID也出现剧烈下调（图4b-c）。由此推测，丙酮酸和乳酸，这两个MCT1转运蛋白底物可能在确保CSR效率方面发挥着相互作用。

为了明确乳酸和丙酮酸的作用，对Mb1^Cre小鼠B细胞（对照B细胞）补充外源性丙酮酸或乳酸。结果表明，添加丙酮酸可以增加IgG1+B细胞的比例（图4d），而添加乳酸并未影响该比例。此外，在没有葡萄糖的情况下，向对照B细胞添加丙酮酸会增加AID的水平（图4e）。然而，在Mct1缺陷的条件下，外源性丙酮酸无法上调IgG1+B细胞的比例（图4f）。

为了评估丙酮酸在进入胞质后的作用，能够绕过MCT1转运的丙酮酸类似物——甲基丙酮酸(MePyr)被用于后续实验。结果显示，补充MePyr显著增加了IgG1+B细胞的比例（图4g）。此外，在没有葡萄糖的情况下，MePyr处理显著增强了Mct1缺陷B细胞中AID的表达（图4h）。

为进一步验证丙酮酸对CSR的影响，Mct1缺陷的A20-sgMct1系被构建（图4i）。在无葡萄糖条件下，丙酮酸以剂量依赖性的方式上调了野生型对照A20细胞中的AID表达，而MePyr上调了A20-sgMct1细胞中的AID表达（图4j-k）。

综上所述，在B细胞的CSR过程中，丙酮酸是确保AID表达的一个关键因素。

图4. 丙酮酸通过保护AID的表达来支持CSR

5、MCT1在CSR B细胞中维持Aicda基因启动子区域的染色质可及性

为了探究MCT1介导CSR的作用机制，Mb1^Cre和Mct1^f/fMb1^Cre小鼠B细胞在LPS和IL-4处理下的全局转录动力学被解析。结果表明，在Mct1缺陷的B细胞中，H3K9、H3K14和H3K27的乙酰化水平均降低，而H3K18乙酰化和H3K27三甲基化基本未变（图5a）。进一步分析，受影响最严重的位点H3K27，其乙酰化可能通过组蛋白乙酰转移酶（CBP或P300）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC或SIRT）来调控（图5b）。

为通过H3K27乙酰化探究MCT1介导的CSR潜在机制，其全基因组情况被分析。结果显示，Mct1缺陷导致Aicda位点的可及性显著降低（图5c），同时Aicda启动子区域的H3K27Ac信号也显著减少（图5d）。因此，MCT1转运蛋白可能通过确保H3K27的乙酰化来促进AID的表达。

图5. MCT1通过葡萄糖代谢支持CSR，为组蛋白乙酰化提供底物

6、丙酮酸促进B细胞中组蛋白H3K27乙酰化

与对照B细胞相比，Mct1缺陷型的HDAC2表达上调；同时，CBP的表达减少，而SIRT1的表达增加（图5b）。当NAM（一种SIRT抑制剂）被应用时，其挽救了Mct1缺陷型中IgG+B细胞比例和AID表达的下降（图 5e-f），再次证实组蛋白乙酰化在B细胞CSR中发挥关键作用。结合定量蛋白质组学分析，丙酮酸直接参与了组蛋白H3K27的乙酰化过程（图 5g）。

为了评估丙酮酸的具体贡献，将Mb1^Cre小鼠B细胞在含有丙酮酸的培养基中与LPS和IL-4共同培养。结果发现，丙酮酸的添加显著上调了H3K27Ac水平（图5h）。相比之下，外源性丙酮酸未能增加H3K27Ac水平，只有补充MePyr后，其水平才得以恢复（图5i），这与前文结果一致。

综上，MCT1转运蛋白通过维持细胞内高浓度的丙酮酸，促进H3K27的充分乙酰化，从而确保Aicda基因的最佳转录。

7、MCT1在SLE患者B细胞中高表达，有望成为SLE治疗的潜在靶点

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫病，与B细胞的异常增殖有关。当包含SLE患者和健康对照不同B细胞亚群的GEO数据库(GSE118254)被分析时，发现SLE患者中IgG类别转换记忆B细胞和活化初始B细胞的MCT1表达显著高于健康对照（图6a）。此外，在两个包含混合B细胞亚群的GEO数据库（GSE10325和GSE4588）中，SLE患者B细胞中的MCT1表达也显著高于健康对照（图6b）。同样地，在研究者自建的临床队列，SLE患者的外周血单个核细胞在mRNA水平上也表现出MCT1表达显著增加（图6c）。

为验证上述临床队列分析结果，bm12诱导的狼疮小鼠模型被构建。结果显示，野生型（Mb1^Cre小鼠）的脾脏显著大于Mct1缺陷型（Mct1^f/fMb1^Cre小鼠）（图6e）。相应地，Mct1缺陷型小鼠的GCBC和IgG1 B细胞比例显著减少（图6f-g），针对dsDNA的IgG抗体水平也显著降低（图6h）。此外，Mct1缺陷还缓解了Mct1^f/fMb1^Cre小鼠的肾炎，这很可能是由于肾小球中IgG自身抗体的积累减少所致（图6i-j）。当使用CHC（MCT1抑制剂）治疗时，其抗dsDNA抗体水平显著降低（图6k-l）。

综上，MCT1在SLE潜在的发病机制和治疗中的作用得到证实。

图6. 在bm12诱导的小鼠狼疮模型中，B细胞MCT1缺陷抑制IgG自身抗体的产生和GC的形成

研究小结

本研究揭示了MCT1通过调控丙酮酸代谢维持H3K27乙酰化水平，从而驱动AID表达及抗体CSR的分子机制。值得注意的是，SLE患者B细胞中MCT1表达显著上调，而Mct1缺陷可有效缓解bm12诱导的小鼠狼疮模型症状。这些发现不仅阐明了B细胞代谢重编程与表观遗传调控之间的功能偶联，更为疫苗开发和SLE治疗提供了潜在靶点。此外，研究首次建立了MCT1介导的丙酮酸代谢-H3K27乙酰化-AID转录轴在体液免疫应答中的核心地位，为代谢干预治疗自身免疫疾病提供了理论依据。

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