文章标题：Integrative multi-omics reveals that Salvia miltiorrhiza active fraction ameliorates rheumatoid arthritis in rats via inhibiting inflammation and ferroptosis

发表期刊：Phytomedicine

影响因子：8.3

研究背景

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是慢性高致残性自身免疫病，需终身管理，现有疗法长期毒性大、费用高。丹参因活血化瘀、抗炎功效临床用于RA治疗，但其RA治疗的特定活性部位及潜在机制尚不明确。近期，广东省新药设计与评价重点实验室金晶教授在Phytomedicine期刊发表题为“Integrative multi-omics reveals that Salvia miltiorrhiza active fraction ameliorates rheumatoid arthritis in rats via inhibiting inflammation and ferroptosis”的研究。该研究以整合多组学技术探索丹参活性部位抗RA的作用及机制，发现丹参乙酸乙酯提取物(ET)可通过调节炎症、铁死亡、氨基酸代谢及滑膜细胞失调改善RA病理，展现出显著治疗潜力。 

研究概览

研究结果

1. 丹参活性部位的筛选与表征

既往证实丹参酮类可治RA，提取物可提升其生物利用度。研究以丹参干燥根为原料，经提取纯化分离得到4个活性部位：乙醇提取部位(YC)、乙酸乙酯提取部位(ET)、总丹参酮部位(T-Tan)、乙酸乙酯洗脱部位(ZCX)。

以小鼠巨噬细胞RAW264.7筛选抗炎效果：RT-qPCR显示，YC、ET、T-Tan均抑制Tnf-α、Il-1β、Il-6的mRNA表达，且ET、T-Tan效果更优（图1A-C）；NO释放实验中，仅ET、T-Tan有效抑制NO释放（图1D）。药代动力学实验显示，ET可显著提高血浆隐丹参酮(CTS)浓度（图1E-G），故确定ET为核心活性部位。经UHPLC-Q Exactive-MS与HPLC分析，明确ET含5种主要化合物（图1H-J），结合现有研究推测其还含丹参醇A、丹参酮甲酯、迷迭香酸等。

图1. 丹参有效活性位点的筛选及提取物成分分析

2. ET可抑制胶原诱导关节炎(CIA)大鼠疾病进展并改善病理

研究通过CIA建立Sprague–Dawley大鼠RA模型，评估ET药效：各组大鼠体重稳步上升、生存状态良好（图2A）；与模型组相比，ET组及阳性药甲氨蝶呤(MTX)组大鼠关节肿胀减轻、足部病变减少（图2B-E）；Micro-CT显示，ET显著改善CIA模型组踝关节模糊、骨侵蚀、间隙变窄（图2F）；H&E染色显示 ，ET减少关节内炎症细胞浸润、改善骨软骨损伤（图2G）；TRAP染色显示， ET减少破骨细胞生成，阻止骨侵蚀（图2H）；ELISA检测显示，ET逆转CIA诱导的血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17a高表达，同时降低踝关节中相关因子的mRNA及蛋白水平（图2I-L）。综上，ET可延缓RA进展、减轻炎症并改善病理。

图2. 丹参ET有效抑制RA大鼠疾病进展，改善病理及生理状况

3. ET改变CIA大鼠的血清代谢组

为明确ET对RA大鼠血清代谢物的调控作用，该研究分析对照组、模型组及ET低剂量组(ETL)大鼠血清代谢物。PCA显示，三组代谢物差异显著（图3A-B）；OPLS-DA显示，模型组与给药组代谢谱差异显著（图3C-D）；差异代谢物热图显示，模型组与正常组代谢物差异极显著，ET处理后代谢物向正常组恢复（图3G）；正离子模式下48种代谢物显著上调、209种显著下调；负离子模式下4种显著上调、63种显著下调（图3H-I）；富集分析显示， ET主要影响溶质载体(SLC)蛋白介导的转运通路（图3J）；通路分析显示， ET主要调控氨基酸代谢通路（图3K）。综上，ET可通过调控RA大鼠氨基酸代谢，使其代谢谱接近正常，缓解RA病理。

图3. RA大鼠血清的非靶标代谢组学分析

4. ET调控巨噬细胞代谢组

通过非靶标代谢组学分析ET对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞代谢物的影响：PCA显示，对照组、模型组、ET处理组区分明显（图4A-B）；OPLS-DA显示，模型组与ET处理组差异显著（图4C-D）。差异代谢物热图显示，LPS刺激后巨噬细胞代谢物显著变化，ET处理后部分代谢物向正常组恢复（图4G）。正离子模式下108种代谢物显著上调、34种显著下调；负离子模式下37种显著上调、25种显著下调（图4H-I）。

研究还发现，ET对细胞代谢物与大鼠血清代谢物的影响相似，均可能通过调控转运蛋白干预氨基酸代谢（图4J-K）。总之，RA病程中巨噬细胞变化对疾病状态起关键作用，探究ET对巨噬细胞的作用机制，对理解其体内疗效意义重大。

图4. ET对RAW264.7细胞非靶标代谢组学的影响

5. ET调控巨噬细胞炎症、铁死亡及氨基酸代谢相关基因表达

为明确ET引发的关键基因变化及通路关联，该研究对RAW264.7细胞开展转录组学研究：造模后2434个基因上调、1191个基因下调（图5A）；与模型组相比，ET处理后186个基因上调、242个基因下调（图5B），热图显示细胞基因表达谱显著改变（图5C）。GO富集分析显示，生物过程层面，ET主要影响炎症、免疫应答通路，调控细胞铁离子稳态；细胞组分层面，变化集中在细胞内外环境，涉及生物膜及转铁蛋白受体复合物；分子功能层面，除细胞因子与趋化因子相关变化外，氨基酸、脂质及铁转运相关蛋白也有改变（图5D-F）。KEGG通路富集分析显示，ET除影响炎症和免疫相关通路外，还调控铁死亡、程序性坏死及部分氨基酸代谢通路（图5G-I），可从多维度调控RAW264.7细胞。

图5. 转录组学分析ET对RAW264.7细胞差异基因及通路的影响

6. ET调控巨噬细胞在炎症、铁死亡及氨基酸代谢中的蛋白表达

为全面解析ET作用机制，该研究还对RAW264.7细胞开展蛋白质组分析。热图显示，模型组与ET处理组的蛋白质组成差异显著（图6A）；ET处理后163个蛋白质上调、184个蛋白质下调（图6B）。GO富集分析显示，生物过程层面，ET主要影响炎症与免疫应答相关蛋白质；细胞组分层面，变化集中在细胞器及细胞膜相关蛋白质；分子功能层面，涉及蛋白质结合、酶结合及金属结合相关蛋白质（图6C-D）。KEGG分析显示，差异蛋白质主要富集于代谢相关通路、铁死亡通路及细胞凋亡/坏死相关通路（图6E-G）。对前3个显著通路做蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析，发现TNF-α、IL-1β、Hmox1为核心枢纽蛋白（图6H）；结合多组学可见，ET显著调控铁死亡通路，且Hmox1变化最显著（图6I），此外铁死亡与炎症通路通过关键蛋白质密切关联（图6J），提示ET影响的通路存在相互调控。

图6. 蛋白质组学分析ET对RAW264.7细胞差异蛋白及通路的影响

7. ET抑制巨噬细胞炎症因子释放并间接影响FLS的增殖与迁移

实验证实，ET显著降低巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶及IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白质表达（图7A-C）。采用巨噬细胞条件培养基培养滑膜成纤维细胞(FLS)：划痕愈合实验显示， ET间接抑制FLS增殖与迁移（图7D-E）；ET还间接下调增殖相关蛋白周期蛋白A2(CCNA2)表达，上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(P21)、1B(P27)表达（图7F-G），并间接抑制FLS释放TNF-α、IL-1β、IL-6（图7H-J）。综上，ET可通过直接与间接作用多通路缓解RA症状。

图7. ET抑制RAW264.7细胞炎症因子释放，间接抑制FLS活化

8. ET抑制RAW264.7细胞铁死亡

基于多组学结果，该研究进一步探究ET对RAW264.7细胞铁死亡的影响：LPS刺激后，细胞脂质过氧化显著，Fe²⁺、Lip-ROS等标志物水平升高（图8A-B）；ET 处理可降低Fe²⁺、Lip-ROS及MDA水平（图8E）。在铁死亡关键蛋白方面，ET可降低4-HNE表达，显著上调Nrf2、Hmox1、SLC7A11、GPX4的蛋白表达，降低ACSL4、ALOX15蛋白水平，上调FTL、FTH表达（图8C-D）。综上，ET主要通过调控脂质过氧化和抗氧化信号通路抑制铁死亡。

进一步研究显示，铁死亡诱导剂RSL3处理细胞后，炎症因子表达显著升高；ET处理可显著抑制该炎症反应，提示铁死亡伴随炎症因子释放，抑制这些因子可调控铁死亡进展（图8F-H）。综上，ET通过多方面改善RA疾病状态，证实其多靶点作用机制，揭示通路交叉调控作用。

图8. ET可抑制RAW264.7细胞的铁死亡

9. ET中的主要化合物可抑制炎症并抵抗铁死亡的发生

研究探究了ET中5种主要化合物(SalB、DIH、CTS、TanI、TanIIA)的活性：检测显示，5种化合物均能抑制IL-1β、IL-6、iNOS的蛋白表达（图9A-D），同时抑制Il-1β、Il-6、Tnf-α的mRNA表达（图9E）；在铁死亡调控方面，5种化合物均能不同程度抑制脂质过氧化，降低Fe²⁺、Lip-ROS水平（图9F-G），且能不同程度上调Nrf2、Hmox1、SLC7A11、GPX4的表达，降低ACSL4、ALOX15的表达，但对FTH、FTL的蛋白表达几乎无影响（图9H-J）。综上，ET的治疗效果是其多种化合物协同作用的结果，符合中医药“多成分、多通路协同治疗疾病”的理念。

图9. ET中主要化合物调节RAW264.7细胞炎症与铁死亡

研究小结

研究团队经体内外筛选与成分分析，锁定丹参ET为抗RA核心活性组分。在CIA大鼠模型中，ET显著改善关节病理损伤、延缓疾病进展；多组学分析揭示其多靶点机制：抑制炎症、调控铁死亡、平衡氨基酸代谢，还通过调控巨噬细胞间接改善FLS异常增殖、迁移及纤维化（图10）。ET成本低、易获取，还解决单一成分口服生物利用度低的问题，治疗潜力显著，既印证中医药协同理念，也为RA治疗提供新方向。

图10. ET通过调节炎症、铁死亡、氨基酸代谢及滑膜细胞失调改善RA病理

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