文章标题：Gut microbial metabolite targets HDAC3-FOXK1-interferon axis in fibroblast-like synoviocytes to ameliorate rheumatoid arthritis

发表期刊：Bone Research

影响因子：15

客户单位：南方科技大学

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种全身性和慢性自身免疫性疾病，其特征是炎症、滑膜增生和骨与软骨的破坏，但现有疾病修饰抗风湿药(Diseasemodifying Antirheumatic Drugs, DMARDs)疗效不足，导致患者留存率较低。遗传学已发现百余显著相关位点及数千个小效应因果变异，多数位于难干预的非编码区，仅能解释约15%的RA表型变异。近年肠道菌群失调被证实与RA相关，且宿主遗传可显著塑造菌群组成，但人群中复杂的混杂因素限制了二者因果关系的推断。本研究利用胶原诱导性关节炎(Collagen-Induced Arthritis, CIA)易感DBA/1J小鼠与CIA抗性C57BL/6J小鼠，结合粪便微生物移植(FMT)、16S测序、转录组、蛋白组及代谢组检测，发现遗传背景决定的保护性菌群——脆弱拟杆菌(B. fragilis)，其通过产生短链脂肪酸(Short-Chain Fatty Acids, SCFAs)之一的丙酸，破坏RA成纤维样滑膜细胞(RA fibroblast-like synoviocytes, RA-FLSs)中HDAC3-FOXK1相互作用、阻断干扰素信号轴，抑制RA-FLSs的肿瘤样转化并使其失活，进而显著缓解关节炎，为RA提供靶向微生态-代谢-表观调控的治疗新策略。

研究结论

01. C57BL/6J小鼠粪便微生物移植赋予DBA/1J小鼠CIA抗性

为了检测C57BL/6J小鼠是否具有抗关节炎的肠道菌群，收集未免疫的C57BL/6J小鼠和DBA/1J小鼠的粪便样本，并在CIA发病前对DBA/1J小鼠进行了粪便微生物移植(Fecal Microbiota Transplantation, FMT)实验（图1a）。与接受供体DBA/1J小鼠粪便的DBA/1J小鼠相比，接受供体C57BL/6J小鼠粪便的DBA/1J小鼠表现出较低的关节炎评分（图1b）。显微CT和HE染色等组织学结果显示，接受供体C57BL/6J小鼠粪便的DBA/1J小鼠骨侵蚀、滑膜炎症和软骨侵蚀减轻（图1c-d）。骨表面/骨体积比(BS/BV)、骨侵蚀、滑膜炎症和软骨侵蚀的量化一致表明，供体C57BL/6J小鼠和受体DBA/1J小鼠之间的FMT可赋予对CIA的抗性（图1e）。

图1. 供体C57BL/6J小鼠与受体DBA/1J小鼠粪便微生物移植及肠道菌群组成差异

02. C57BL/6J和DBA/1J小鼠肠道微生物组成的差异

使用未免疫的DBA/1J小鼠和C57BL/6J小鼠的粪便样本进行了高通量16S rRNA基因测序分析。DBA/1J和C57BL/6J小鼠之间的微生物组成有明显的分离（图1f-g）。火山图显示两个小鼠品系在属水平上的OTUS差异丰富，其中拟杆菌属在C57BL/6J小鼠中富集程度最高且 P 值最低（图1i）。线性判别分析(LDA)结果表明，C57BL/6J小鼠中富集的5个菌属包含拟杆菌属（图1j）。

通过RT-PCR检测未免疫DBA/1J小鼠和C57BL/6J小鼠粪便中人类相关拟杆菌种，发现脆弱拟杆菌(B.fragilis)、埃格特拟杆菌(B.eggerthii)和斯特氏拟杆菌(B.stercoris)在C57BL/6J小鼠粪便中显著富集（图1k）。此外，基于GMrepo数据库比较RA患者与健康对照组(HC)粪便中拟杆菌属及脆弱拟杆菌的丰度，发现RA患者的拟杆菌属和脆弱拟杆菌水平均低于健康对照组（图1l-m）。这些结果表明，脆弱拟杆菌可能与抗关节炎相关。

03. 脆弱拟杆菌移植改善DBA/1J小鼠关节炎

接下来评估了脆弱拟杆菌移植对CIA的保护潜力。在CIA发病前，DBA/1J小鼠经灌胃给予脆弱拟杆菌（实验组）或等量培养基（对照组）（图2a），证实了脆弱拟杆菌的定植效果（图2b）。与对照组相比，脆弱拟杆菌移植显著降低了DBA/1J小鼠的血清IgG水平和关节炎评分（图2c-d），改善了骨质侵蚀、滑膜炎症和软骨侵蚀（图2e-f），证实了脆弱拟杆菌对DBA/1J小鼠关节炎的保护作用（图2g）。此外，还评估了脆弱拟杆菌移植在已建立CIA的DBA/1J小鼠中的治疗潜力。在II型胶原免疫后，给出现关节炎症状的DBA/1J小鼠口服脆弱拟杆菌（实验组），以口服培养基的CIA小鼠为对照（图2h），观察到脆弱拟杆菌在CIA小鼠体内的有效定植（图2i）。脆弱拟杆菌移植可降低CIA小鼠的血清IgG水平和关节炎评分（图2j-k），并抑制骨侵蚀、滑膜炎症和软骨侵蚀（图2l-n）。这些结果表明，脆弱拟杆菌可能是一种有益的肠道细菌，可抑制关节炎的发生与进展。

图2. 脆弱拟杆菌移植对DBA/1J小鼠关节炎发展的影响

04. 脆弱拟杆菌衍生的丙酸参与关节炎抵抗

拟杆菌能通过发酵膳食多糖产生各种SCFAs。使用Picrust2软件和MetaCyc数据库，进行了基于16S rRNA基因测序与SCFAs代谢相关的功能预测。与DBA/1J小鼠相比，C57BL/6J小鼠中糖酵解、淀粉降解等与SCFAs产生相关的代谢途径显著富集（图3a）。用GC-MS分析C57BL/6J和DBA/1J小鼠粪便样品中SCFAs的含量，与DBA/1J小鼠相比，C57BL/6J小鼠的丙酸、丁酸和戊酸水平显著更高，而乙酸和异丁酸水平无明显差异（图3b）。由于脆弱拟杆菌是C57BL/6J小鼠的优势菌，且脆弱拟杆菌移植改善了DBA/1J小鼠的关节炎，因此检测了脆弱拟杆菌发酵培养液中丙酸、丁酸和戊酸的水平，并观察到脆弱拟杆菌产生的丙酸比丁酸和戊酸更多（图3c），提示脆弱拟杆菌产生的丙酸可能参与了对关节炎的抵抗。

此外还收集了RA和HC患者的血浆样本，并进行了非靶标代谢组学分析，RA与HC具有显著不同的代谢特征（图3d-g）。代谢富集分析(metabolite set enrichment analysis，MSEA)显示，与HC患者相比，RA患者中TCA循环、丙酮酸代谢等SCFAs相关的代谢途径显著下调（图3h）。结合生化途径和化学关系的代谢网络表明，HC患者的TCA循环、丙酮酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢显著富集（图3i）。此外，利用靶标代谢组学检测了血浆样本中丙酸的水平，观察到RA患者的丙酸水平低于HC患者（图3j）。这些结果提示类风湿关节炎患者SCFAs相关的代谢途径异常，导致丙酸的产生减少，对关节炎的抵抗力丧失。

图3. 肠道微生物功能预测及人类血浆代谢组学分析

05. 丙酸体外抑制RA-FLSs的病理表型

在RA的发展过程中，RA-FLSs获得了一系列肿瘤样表型，包括高增殖能力、增强迁移和侵袭、促进抗凋亡等。此外，RA-FLSs还产生如IL-6、IL-1β、TNF-α和MMPs等炎症介质。CCK-8和集落形成实验表明，丙酸在体外以浓度依赖的方式抑制RA-FLSs的增殖（图4a-b）。此外还检测了丙酸对RA-FLSs其他侵袭性表型的影响。Transwell迁移实验、侵袭实验及伤口愈合试验均表明，丙酸处理的RA-FLSs迁移和侵袭能力显著受到抑制（图4c-d）。流式细胞仪分析显示丙酸可促进RA-FLSs的凋亡（图4e）。与对照组相比，丙酸处理的炎症相关基因（MYD88、NF-κB、ICAM、PTPN2和TLR3）、趋化因子和炎性细胞因子（CXCL11、TNF-α、CCL2、IL-6和CXCL8）以及迁移和侵袭相关基因（MMP13、PDGFR和MMP1）的表达均降低（图4f-h）。

图4. 丙酸对RA-FLSs体外肿瘤样表型的影响

06. 丙酸干扰HDAC3-FOXK1相互作用降低FOXK1蛋白稳定性

为了探讨丙酸抑制RA-FLSs病理表型的机制，对经丙酸或对照(PBS)处理的RA-FLSs进行了RNA测序分析（图5a）。丙酸处理组与对照组的RA-FLSs之间存在大量差异表达基因（图5b）。基因集富集分析(GSEA)显示，丙酸处理后，参与RA-FLSs免疫和瘤样转化的途径显著下调（图5c）。此外，对RA-FLSs进行蛋白质组学分析，检测到两组间存在差异表达的蛋白质（图5d-e）。蛋白功能富集分析表明，丙酸处理的RA-FLSs中，包括干扰素反应、适应性免疫系统和白介素类在内的信号通路显著下调（图5f）。根据RNA测序和蛋白质组学数据进行Venn分析，以筛选丙酸处理后RA-FLSs中共同下调的蛋白编码基因（图5g）。重叠的蛋白编码基因主要参与干扰素途径（图5h），这意味着丙酸主要通过阻断干扰素途径抑制RA-FLSs的病理表型。

图5. 丙酸处理后RA-FLSs的转录和蛋白质组学分析

为了探索丙酸如何调节RA-FLSs中的干扰素途径，分析了蛋白质组学中两组之间涉及干扰素途径的所有差异表达蛋白（图5i）。在RA-FLSs中，丙酸使FOXK1的表达下调，但在mRNA水平上没有下调（图5i-j）。FOXK1基因敲除抑制了RA-FLSs中干扰素途径基因、炎症相关基因、趋化因子和炎性细胞因子以及迁移和侵袭相关基因的表达（图5k-o）。丙酸是表观遗传调节因子HDAC3的抑制剂。为了测试FOXK1是否是RA-FLSs中HDAC3的新底物，进行了免疫共沉淀试验，结果表明FOXK1与HDAC3有相互作用（图5p）。使用丙酸或另一种HDACs抑制剂曲古抑素A(TSA)来控制HDAC3的活性，TSA以浓度依赖性方式增加了FOXK1的乙酰化水平，并降低FOXK1、STAT1和STAT2的蛋白水平（图5q）。TSA诱导的FOXK1降解可以被溶酶体抑制剂Bafilomycin A1(BafA1)而不是蛋白酶体抑制剂MG132逆转，这表明HDAC3和FOXK1之间的相互作用是保护FOXK1免受溶酶体系统介导的降解以维持干扰素信号所必需的（图5r）。丙酸中断了RA-FLSs中FOXK1和HDAC3之间的相互作用（图5s）。经丙酸处理后，RA-FLSs中FOXK1的赖氨酸乙酰化水平增加（图5t）。丙酸以浓度依赖的方式降低FOXK1、STAT1和STAT2的蛋白水平（图5u）。以上结果表明，在病理条件下，HDAC3与FOXK1相互作用，使FOXK1去乙酰化，通过抑制FOXK1的溶酶体降解而增加FOXK1蛋白的稳定性，导致干扰素信号增强和RA-FLSs的激活；而丙酸破坏HDAC3-FOXK1的相互作用，降低FOXK1的蛋白质稳定性，导致干扰素信号传导受阻，RA-FLSs失活（图5v）。

07. 丙酸单药或与抗TNF药物联合应用缓解CIA小鼠关节炎

接下来研究了丙酸或其与生物类抗TNF药物依那西普联合治疗CIA模型DBA/1J小鼠关节炎的可能性。CIA小鼠分为对照组、丙酸处理组、依那西普单药组及丙酸与依那西普联合处理组（图6a）。治疗后，关节炎评分显示，与对照组相比，丙酸显著阻碍了CIA的进展，骨侵蚀减轻（图6b-d）。H&E和SafO-FG染色的组织学分析显示，丙酸对滑膜增生、骨侵蚀和软骨破坏有显著的抑制作用，测量踝关节BS/BV及定量滑膜评分、骨侵蚀和软骨侵蚀等结果，一致证明丙酸对CIA小鼠有良好的治疗效果（图6e-f）。免疫荧光染色显示，丙酸显著降低CIA小鼠滑膜组织中FOXK1、STAT1、STAT2、IL-6、IL-1β和MMP3的表达（图6g-h）。此外，还评估了丙酸联合治疗的效果，与依那西普单药治疗相比，丙酸与依那西普联合使用更显著地缓解了CIA（图6b-h）。

丁酸已被报道具有治疗RA的潜力，因此还测试了丁酸单药或其与依那西普联合治疗CIA小鼠关节炎的效果（图6a）。结果显示，与对照组相比，丁酸减轻了CIA，减少了骨侵蚀，显著抑制滑膜增生、骨侵蚀和软骨破坏（图6b-d）；与依那西普单药治疗相比，丁酸与依那西普联合治疗在缓解CIA方面显示出协同作用（图6b-f）。此外，还比较了丁酸和丙酸的治疗效果，无论是单药治疗还是与依那西普联合治疗后，丁酸在减轻CIA小鼠关节炎方面均不如丙酸有效（图6b-f）。

图6. 丙酸单独使用或与抗TNF药物依那西普联合使用对CIA小鼠的治疗效果

研究总结

通过分析CIA抗性小鼠品系和CIA敏感小鼠品系之间的肠道微生物组成差异，本研究揭示了肠道微生物与关节炎易感性之间的因果关系。脆弱拟杆菌是一种抗关节炎的有益肠道细菌，可用于开发以微生物群为导向的类风湿关节炎治疗方法（如脆弱拟杆菌移植）。来源于脆弱拟杆菌的丙酸可抑制RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)中的HDAC3-FOXK1-干扰素途径，进而抑制RA-FLSs的肿瘤样转化并使其失活，可作为治疗RA的潜在药物，其单药或与抗TNF药物联合使用均能有效缓解关节炎。

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