英文标题：Global Profiling of Lysine Succinylation Reveals Acetylation Crosstalk Underlying Metabolic Regulation in Chlamydomonas reinhardtii
发表期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
影响因子：6.2
研究背景
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种被美国FDA认定为一般公认安全的绿色微藻，具有遗传操作成熟、光合效率高、培养规模易放大等优势，已成为合成生物学和绿色生物制造的重要底盘，广泛用于生物燃料、高值化合物及环境修复等领域。然而，要实现对其碳代谢流的精准调控，仍需深入解析代谢网络的翻译后修饰调控机制。
赖氨酸琥珀酰化(Lysine succinylation，Ksu)是一种进化保守的翻译后修饰，通过将琥珀酰基共价连接到赖氨酸残基，改变蛋白质电荷与结构，从而调控酶活性。研究表明，琥珀酰化主要参与TCA循环、碳固定、脂肪酸合成等核心代谢通路，并与乙酰化等修饰存在广泛的串扰，形成复杂的代谢调控网络。尽管在多种植物和微生物中已绘制琥珀酰化图谱，但莱茵衣藻中琥珀酰化的全局分布及其代谢调控功能仍属空白。乙酰辅酶A合成酶(ACS)是乙酸同化和乙酰辅酶A生成的关键酶，已知可被乙酰化调控，但琥珀酰化对其活性的影响尚未明确。因此，针对上述热点难题，该研究整合免疫富集与高通量质谱技术，首次系统解析莱茵衣藻Ksu修饰谱，揭示其与乙酰化的代谢串扰机制，明确关键修饰位点的调控功能，为微藻精准代谢工程提供理论依据与分子靶点。
研究结论
01.莱茵衣藻在生理与胁迫条件下Ksu的动态分析
为探究Ksu的环境响应规律，研究采用蛋白免疫印迹技术，首先检测了莱茵衣藻在不同生理条件（自养、异养、混养、高光）与非生物胁迫（氮磷缺乏、盐胁迫、镉、纳米塑料）下的全局琥珀酰化水平。主要结果如下：
①琥珀酰化修饰广泛存在于莱茵衣藻中，在不同蛋白分子量区域均可检测到阳性修饰条带。相较于混养条件，自养与异养条件下的琥珀酰化整体信号显著减弱，高光处理会进一步降低其修饰水平（图1A），说明琥珀酰化修饰可随营养模式与光照强度发生动态变化。
②在各类非生物胁迫下，多个蛋白条带的琥珀酰化信号出现明显差异（图1B），暗示着琥珀酰化可能参与衣藻应对胁迫的能量代谢重编程。
尽管蛋白免疫印迹技术无法实现精准定量分析，但不同培养与胁迫条件下琥珀酰化条带的规律性变化充分证明，Ksu是一种动态可调控的翻译后修饰，在莱茵衣藻的环境代谢适应过程中具有潜在调控功能。
图1.不同培养条件下莱茵衣藻的全局Ksu图谱
02.莱茵衣藻Ksu的全蛋白质组图谱
依托免疫亲和富集与高通量质谱技术，研究系统绘制出莱茵衣藻的琥珀酰化修饰图谱（iProX数据库，PXD066150），实验设计和工作流程如图2A所示。其中，三次生物学重复一致鉴定出461种蛋白上的1,027个位点（图2B-C），验证了实验的高可靠性。亚细胞定位显示，琥珀酰化蛋白主要富集于叶绿体和细胞质，暗示该修饰在光合作用与胞内代谢调控中承担核心功能。另外，超六成蛋白含有多个修饰位点，特别是TCA循环的顺乌头酸酶（27个位点）和糖酵解途径的磷酸甘油酸激酶（21个位点）呈现高度修饰。综合来看，Ksu广泛存在于莱茵衣藻中，且显著富集于关键代谢酶，表明其作为关键的翻译后修饰，深度参与细胞代谢网络的精细化调控。
图2.莱茵衣藻Ksu组分析的实验流程与重复性验证
03.琥珀酰化蛋白的代谢相关功能解析
结合KOG、KEGG分类及GO、KEGG富集分析（图3），莱茵衣藻琥珀酰化蛋白的功能特征被逐步解析。在KOG与KEGG分类中，琥珀酰化蛋白主要参与翻译后修饰、核糖体翻译及能量代谢，核心介导能量转化与氨基酸、碳水化合物、脂质的代谢转运，两类分析结果高度一致。GO富集分析表明，琥珀酰化蛋白在生物学过程中显著富集于酰胺生物合成、翻译与光合作用；细胞组分集中在细胞质、叶绿体和核糖体；分子功能以结合与催化活性为主，与亚细胞定位结果相互印证（图3A）。KEGG通路富集显示，琥珀酰化蛋白显著富集于核糖体、中心碳代谢、脂肪酸合成及光合作用等通路，其中TCA循环富集倍数最高，为Ksu的核心调控靶点。结合琥珀酰化与琥珀酰辅酶A的生化关联，Ksu可通过反馈调控TCA循环影响碳流分配（图3B）。简言之，Ksu广泛参与莱茵衣藻核心生命活动，是调控能量代谢的重要翻译后修饰方式。
图3.莱茵衣藻Ksu蛋白的功能富集分析
04.互作网络揭示琥珀酰化相关代谢模块
借助STRING数据库结合Cytoscape软件，研究构建蛋白质互作网络，并完成可视化分析，进一步阐明了琥珀酰化蛋白之间的功能关联（图4）。结果而言，12个显著富集的通路在高度互连的网络聚类中被鉴定，主要包括：核糖体、TCA循环、氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、乙醛酸和二羧酸代谢、光合生物碳固定，以及多种氨基酸代谢通路。因此，琥珀酰化蛋白并非独立发挥作用，而是形成紧密协作的功能模块，集中参与翻译调控与能量代谢过程，表明Ksu通过协同调控多通路蛋白，系统性维持衣藻核心代谢稳态。
图4.琥珀酰化蛋白的蛋白质-蛋白质互作网络分析
05.中心代谢的关键酶普遍发生琥珀酰化
为系统明晰琥珀酰化在代谢通路中的分布，研究接着将鉴定到的琥珀酰化蛋白映射到KEGG通路上（图5）。整体而言，中心碳代谢、氨基酸生物合成、脂肪酸代谢及卡尔文循环中的大量酶均发生不同程度的琥珀酰化。值得注意的是，几乎所有糖酵解/糖异生和TCA循环的关键酶均被琥珀酰化，且多数含超过10个位点。具体包括：糖酵解的磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)；TCA循环的异柠檬酸脱氢酶(IDH)和α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)；磷酸戊糖途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)；脂肪酸生物合成中的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)。此外，卡尔文循环的关键酶RuBisCO和SBPase同样发生琥珀酰化。这些修饰靶点多为调控代谢进程、决定碳流分配的限速关键酶，其广泛的琥珀酰化修饰特征表明，赖氨酸琥珀酰化可系统性协调多条核心代谢网络，是调控莱茵衣藻代谢稳态的重要翻译后修饰层级。同时，该结果与现有结论相符，亦证实了琥珀酰化修饰在莱茵衣藻代谢调控中的保守性功能。
图5.莱茵衣藻核心代谢通路中Ksu蛋白概览
06.琥珀酰化与乙酰化共修饰凸显代谢调控作用
翻译后修饰串扰构成复杂的调控网络，通过协同或竞争效应精细调控蛋白质功能。为探究琥珀酰化与乙酰化的潜在关联，研究整合莱茵衣藻琥珀酰化组数据与公开乙酰化组数据（图6），结果发现：
①28.5%的修饰蛋白同时存在两种修饰，14.1%的琥珀酰化位点与乙酰化共享相同赖氨酸残基。
②共修饰蛋白显著富集于核糖体、TCA循环、光合碳固定、光合作用、糖酵解/糖异生及脂肪酸生物合成通路；独有乙酰化蛋白主要关联脂肪酸降解与不饱和脂肪酸合成；独有琥珀酰化蛋白则集中于氧化磷酸化及氨基酸代谢。
综上，Ksu与乙酰化在莱茵衣藻中形成一种“协同调控、分工特异”的调控模式：在中心碳代谢等核心通路协同作用，同时通过特异通路分工，实现对代谢网络的精准分层调控。
图6.莱茵衣藻中Ksu与乙酰化之间的串扰分析
07.Ksu与乙酰化的串扰调控ACS3活性
结合琥珀酰化组学数据（图5）可知，乙酸同化核心酶ACS3存在着多处琥珀酰化修饰，是代谢调控的关键靶点。莱茵衣藻ACS家族共有ACS1、ACS2、ACS3三个同源蛋白，但本研究仅在ACS3上鉴定出7个琥珀酰化位点，其中4个位点同时存在乙酰化修饰，两种修饰存在明显串扰（图7A）。多序列比对证实，K597是藻类与高等植物ACS中唯一高度保守的位点（图7B）；同时，该位点位于ACS催化核心的AMP结合结构域α-螺旋区（图7C），是调控酶活的关键位点。研究利用定点突变获得K597R、K597Q、K597D三类突变体，分别模拟蛋白未修饰、乙酰化与琥珀酰化状态，经蛋白纯化后完成酶活测定（图7D）。结果显示，K597R保持野生型酶活，K597Q酶活降至70%，K597D酶活仅为40%（图7E），证明K597酰化会抑制ACS3活性，且琥珀酰化的抑制作用更强。另外，系统发育分析还发现，Cre05.g234663.t1.1与人类去琥珀酰化酶SIRT5高度同源，推测其为莱茵衣藻潜在的去琥珀酰化酶，可参与ACS3修饰的动态调控。
图7.K597位点Ksu与乙酰化的串扰调控ACS3酶活性
研究总结
本研究以莱茵衣藻为研究对象，首次系统绘制其Ksu全蛋白质组图谱，鉴定到791个蛋白上的2806个高置信度琥珀酰化位点，修饰蛋白主要定位于叶绿体、细胞质与线粒体，显著富集于碳代谢、脂代谢、三羧酸循环及光合作用等核心代谢通路；研究证实Ksu与乙酰化存在广泛的修饰串扰，二者在序列基序、结构偏好及通路调控上兼具共性与特异性，共同构成核心代谢的分层调控网络；定点突变与酶活实验进一步明确，乙酰辅酶A合成酶ACS3的K597位点琥珀酰化可显著抑制酶活性，且抑制作用强于乙酰化，是调控乙酸同化与碳流分配的关键位点，同时筛选出莱茵衣藻潜在的去琥珀酰化酶Cre05.g234663.t1.1。总的来说，该研究揭示了Ksu在莱茵衣藻代谢调控中的关键作用与酰化修饰串扰机制，为微藻精准代谢工程改造提供了全新的理论依据与分子靶点。
