文章标题：Iron-mediated ferroptosis impairs CAR-T cell function and antitumor efficacy

发表期刊：nature cancer

影响因子：28.0

客户单位：浙江大学良渚实验室

百趣提供服务：定量脂质6K高通量靶标定量、氧化脂质高通量靶标定量

研究背景

CAR-T疗法虽可使血液肿瘤患者获得短期完全缓解，但远期复发率高，CAR-T在体内长期存续是维持持久抗肿瘤疗效的核心，现有改良手段仍存在局限。已知活化诱导凋亡、坏死性凋亡、焦亡均会造成CAR-T损耗，而铁死亡是否介导人体CAR-T功能衰退及其调控机制尚不清晰。

铁对T细胞呈双向调控：生理浓度铁维持T细胞发育与活化，胞内铁过载则损伤细胞并诱发铁死亡；该过程的关键环节为铁过载诱导线粒体活性氧(ROS)累积，进而触发ACSL4介导脂质重塑。临床样本显示，CAR-T输注约2周进入细胞衰减期，患者血清铁、易氧化多不饱和脂肪酸同步升高；无应答患者基线铁指标偏高，但该关联仍需大样本临床队列验证。体外与动物实验证实，单纯调控胞内铁水平无法修复铁过载导致的CAR-T功能损伤。

本研究结合复发难治多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)、急性B淋巴细胞白血病(B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia, B-ALL)患者临床样本、体外CAR-T培养模型及荷瘤小鼠模型开展多层次验证，证实铁蓄积可诱导人体CAR-T发生铁死亡，解析线粒体氧化应激-ACSL4脂质过氧化分子通路，并验证铁死亡抑制剂预处理、ACSL4基因敲除两种干预策略的保护与抗肿瘤增效作用，为提升CAR-T体内持久存续能力提供具备转化潜力的全新靶点。

研究结果

01.接受CAR-T细胞治疗患者体内铁死亡现象鉴定

本研究采集MM、B-ALL患者CAR-T输注后多个时间点外周血样本（图1a–b），证实两类患者细胞回输约2周后，CAR-T细胞均进入数量衰减阶段。研究选取4例MM患者扩增期与衰减期样本开展单细胞RNA测序，结合t-SNE分群及单样本基因集富集分析（图1c–e）：四类程序性死亡通路中仅铁死亡通路上调，氧化磷酸化、脂肪酸代谢通路同步富集，共同使CAR-T细胞趋向铁死亡易感状态，但该转录变化无统计学差异。

鉴于铁死亡主要受转录后调控，研究进一步检测铁死亡相关蛋白标志物（图1f–g）。结果显示衰减期CAR-T细胞内脂质过氧化标志物4-HNE显著升高，GPX4表达下调、ACSL4与COX2表达上调，铁储存蛋白FTH1同步升高，共同证实脂质过氧化与胞内铁过载同步发生。横断面检测结果（图1h–k）表明，仅衰减阶段的CAR-T细胞脂质ROS、不稳定二价铁水平显著上升，普通T细胞无此特征。

基线血清无标记定量蛋白组质谱结果（图1l–m）显示，B-ALL队列中完全缓解、无应答患者各5例，无应答者血清FTL、FTH1表达丰度更高，提示治疗前铁负荷可能影响CAR-T疗效。综合上述多组学、流式及蛋白临床证据，证实铁死亡是CAR-T细胞体内耗减的核心途径。

图1.CAR-T细胞表现出铁死亡特征

02.抑制铁死亡可改善CAR-T细胞治疗效果

本研究先开展体外CAR-T细胞培养实验，评价三种铁死亡抑制剂，4 μM Fer-1提升细胞活力效果最优，可上调中央记忆型CAR-T比例、下调耗竭分子表达，证实制备阶段阻断铁死亡可兼顾细胞存活与优质记忆表型。

研究进一步构建Nalm6荧光白血病NSG小鼠模型开展体内验证（图2a–d），经抑制剂预处理的CAR-T可有效控制肿瘤、延长荷瘤小鼠生存期，其中Fer-1疗效最佳；后续设置腹腔持续给药方案维持体内铁死亡抑制（图2e），仅单独使用抑制剂会促进肿瘤进展，但与CAR-T联合给药可显著减轻肿瘤负荷（图2f–h）。小鼠体内CAR-T检测结果显示，第16天铁死亡标志物相较第8天明显上调，Fer-1能够减少脂质ROS蓄积、提升体内CAR-T存留量、富集记忆细胞、缓解细胞耗竭并保留细胞活化功能（图2i–r）；在细胞因子释放综合征(CRS)模型中，Fer-1还可降低促炎因子水平，不存在加重全身炎症的风险（图2s–z）。整体动物实验证实，CAR-T制备阶段采用Fer-1预处理，可安全提升CAR-T在体内的功能与抗肿瘤疗效。

图2.Fer-1可增强CAR-T细胞的体内抗肿瘤疗效

03.血清来源铁过载诱发CAR-T细胞发生铁死亡

本研究多维度验证了血清铁过载诱导CAR-T细胞铁死亡、影响治疗效果的核心机制。临床样本检测显示，CAR-T细胞衰减期存在明显胞内铁蓄积（图1g、j、k），伴随铁代谢基因反馈调控异常；患者衰减期血清铁水平显著高于扩增期（图3a-b），无应答患者基线血清铁、铁蛋白水平更高（图3c），提示基线铁代谢紊乱可能与不良预后存在关联。同时，衰减期患者血清富集亚油酸、花生四烯酸等促铁死亡多不饱和脂肪酸（图3d-e），与高铁环境协同促进脂质过氧化，且CAR-T铁死亡主要发生于体内回输后，体外培养阶段无明显损伤。

体外实验证实，常规CAR-T培养基铁含量极低，生理浓度柠檬酸铁干预可造成CAR-T胞内铁过载，引发脂质过氧化、抑制细胞增殖并诱导细胞死亡，且晚期终末分化CAR-T对铁死亡更敏感；仅Fer-1可有效逆转铁过载造成的细胞损伤与氧化应激紊乱，经铁处理的CAR-T细胞还会出现铁死亡特征性线粒体皱缩形态。

体内动物实验通过饮食干预构建不同铁负荷小鼠模型（图3f），结果显示单纯调整饮食铁含量对肿瘤进展无明显影响，但高铁饮食会显著加重接受CAR-T治疗小鼠的肿瘤负荷、缩短生存期，并上调CAR-T脂质ROS水平（图3g–k）；剔除肿瘤干扰后，高铁环境依旧可直接诱发CAR-T铁死亡（图3l–o），而体内给予Fer-1干预能有效抑制铁死亡，提升CAR-T存留数量与抗肿瘤功能。综上，临床、体外细胞及动物体内实验共同证实，机体血清铁蓄积会诱导CAR-T细胞发生铁死亡，最终削弱CAR-T的治疗疗效。

图3.血清源性铁过载可诱导CAR-T细胞在体内发生铁死亡

04.靶向脂质过氧化可缓解铁诱导的CAR-T细胞功能损伤

CAR-T抗肿瘤疗效取决于细胞完整功能，主要包括记忆表型稳定维持、低耗竭状态、持续细胞因子分泌与长期存活。临床样本流式数据显示，CAR-T进入数量衰减、铁死亡易感阶段时，细胞功能同步出现明显缺陷（图4a–c），提示铁过载会在细胞发生铁死亡之前就破坏CAR-T正常功能。体外实验证实，采用生理浓度(20μM)、高浓度(50μM)柠檬酸铁干预CAR-T，均会抑制细胞活化、减少CD8阳性亚群占比、推动细胞终末分化并上调多重耗竭标志物（图4d–j）；同时显著削弱CAR-T对肿瘤细胞的杀伤能力与胞内细胞因子分泌水平（图4k–m），仅生理水平铁刺激即可复刻临床患者体内CAR-T的功能缺陷，证明铁应激是造成CAR-T功能受损的核心诱因。

研究对126种铁死亡相关抑制剂开展功能筛选，综合指标显示Fer-1的保护效果最优（图4n-o）。多参数流式检测证实，Fer-1可维持CAR-T中央记忆表型、阻断铁介导的异常分化，降低PD1⁺TIM3⁺LAG3⁺三重阳性耗竭细胞比例（图4p–s）；同时显著恢复铁应激环境下CAR-T的肿瘤杀伤能力与细胞因子分泌功能（图4t–x），且该保护效应在肿瘤抗原持续刺激下依旧稳定存在（图4y）。综上，脂质过氧化是铁过载造成CAR-T功能损伤的核心通路，靶向抑制脂质过氧化能够有效逆转铁应激带来的CAR-T功能缺陷。

图4.铁过载诱发铁死亡并损伤CAR-T细胞功能

05.线粒体是介导CAR-T细胞铁应激的核心介质

线粒体对铁代谢失衡高度敏感，线粒体结构与功能完整是维持CAR-T细胞稳态的关键。铁暴露可上调氧化磷酸化、ROS代谢、脂肪酸代谢等铁死亡相关通路，该代谢紊乱可被Fer-1逆转（图5c），提示线粒体紊乱与氧化还原应激是铁诱导CAR-T铁死亡的重要诱因。体外耗竭型CAR-T线粒体数量显著减少，临床CAR-T衰减阶段线粒体总量及膜电位同步下降，证实线粒体完整性与CAR-T功能密切相关。铁过载可造成线粒体结构损伤、激活ROS相关基因（图5d–f），导致线粒体ROS与胞内总ROS大量蓄积（图5g），诱发脂质过氧化，最终造成CAR-T功能损伤，而Fer-1可有效改善上述异常。

铁暴露对线粒体代谢具有双重调控效应：短期铁暴露可小幅提升备用呼吸容量，长期铁过载则抑制线粒体呼吸功能、升高质子漏、降低ATP生成（图5h–k）。持续铁过载过度激活电子传递链，通过芬顿反应放大氧化应激与脂质过氧化，使线粒体成为铁死亡应激的关键放大枢纽。

ROS清除剂GSH、NAC仅能轻微缓解氧化应激与耗竭表型，无法有效纠正细胞分化异常、细胞活力及杀伤功能缺陷，说明普通抗氧化剂难以修复脂质过氧化损伤与线粒体能量代谢缺陷。此外，铁过载会导致溶酶体数量增多、酸化功能障碍。铁应激同时损伤线粒体、溶酶体多种细胞器，因此单一通路干预难以完全恢复CAR-T细胞稳态。

图5.细胞内铁过载可导致线粒体损伤及ROS积聚

06.铁通过激活ACSL4诱导CAR-T细胞发生铁死亡

靶向铁转运相关基因无法修复铁造成的CAR-T损伤，而脂质过氧化抑制剂Fer-1可发挥保护作用，说明铁下游脂质过氧化是介导细胞损伤的核心通路。氧化脂质检测证实，铁刺激会大幅积累多不饱和磷脂氧化产物。ACSL4是启动脂质过氧化的上游关键酶，CAR-T体外扩增过程与患者体内CAR-T细胞中ACSL4表达均随时间持续升高（图6a）；铁处理仅轻微上调ACSL4总蛋白水平，但可显著促进ACSL4磷酸化修饰、提升其酶活性（图6b-c），进而激活脂质过氧化通路。

利用CRISPR构建ACSL4敲除CAR-T细胞后，细胞可抵御铁诱导的铁死亡，减少4-HNE与脂质ROS蓄积，同时逆转铁对COX2、GPX4、SLC7A11的异常调控（图6c–e）。脂质组学结果显示，敲除ACSL4可显著抑制铁介导的脂质重塑，降低甘油磷脂、高不饱和磷脂等易发生过氧化的脂质底物含量（图6f–j），阻断多不饱和磷脂的氧化消耗过程。

功能层面，ACSL4敲除能够恢复CAR-T细胞活化能力、维持中央记忆T细胞占比，下调PD1、TIM3、LAG3多重耗竭标志物（图6k–o）；该保护效应仅特异性拮抗铁应激损伤，不会改变CAR-T细胞正常基础功能。12h体外共培养杀伤实验结果显示，ACSL4敲除组CAR-T细胞存活数量与肿瘤杀伤能力显著提升，残留肿瘤细胞负荷明显下降（图6p–s）。综上，ACSL4是铁蓄积诱发CAR-T脂质过氧化、细胞功能损伤与铁死亡的关键介导分子。

图6.铁离子可激活CAR-T细胞中的ACSL4，从而触发铁死亡

体内动物实验进一步验证疗效：在NALM6白血病小鼠模型中，ACSL4敲除CAR-T抗肿瘤清除能力显著优于野生型（图7a），可有效降低肿瘤负荷、延长小鼠生存期至60天以上，并改善体内CAR-T细胞留存与表型（图7b–d）。在143B-GFP实体瘤模型中，ACSL4敲除或Fer-1处理均可抑制肿瘤生长，其中ACSL4敲除组肿瘤完全缓解率达42.86%（图7e–g）。肿瘤病理结果显示，两组均存在明显CAR-T浸润与肿瘤坏死，可有效延缓肿瘤进展（图7h–j）。安全性检测证实，ACSL4敲除不会诱发过度炎症反应，无CRS风险。相较于短期Fer-1药物干预，ACSL4基因敲除可实现长效铁死亡抑制，抗肿瘤效果更强、更持久。

综上，ACSL4是铁介导CAR-T脂质过氧化、细胞耗竭与铁死亡的核心靶点，靶向敲除ACSL4可显著提升CAR-T在血液瘤及实体瘤中的治疗效果与安全性。

图7.靶向ACSL4可逆转血液系统及实体瘤模型中CAR-T细胞因铁离子引起的功能损伤

研究总结

本研究证实铁过载会诱导线粒体功能紊乱，通过磷酸化激活ACSL4启动脂质过氧化，进而引发CAR-T细胞铁死亡与功能耗竭。Fer-1药物干预或ACSL4基因敲除均可缓解上述细胞损伤，恢复CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力并维持记忆表型、减轻细胞耗竭。体内动物实验证实，ACSL4敲除相比短期Fer-1处理可长效改善CAR-T功能，显著提升CAR-T在血液瘤、实体瘤小鼠模型中的抗肿瘤疗效，且不会增加细胞因子释放综合征(CRS)发生风险。该研究完整阐明铁介导CAR-T细胞损伤的分子通路，为改善CAR-T长期抗肿瘤疗效提供ACSL4这一新的干预靶点。