英文标题：Xian-Lian-Jie-Du Decoction suppresses colorectal cancer liver metastasis by inhibiting Plaur/Hbegf/EGFR-mediated actin cytoskeleton remodeling

中文标题：仙连解毒汤通过抑制Plaur/Hbegf/EGFR介导的肌动蛋白细胞骨架重塑，阻断结直肠癌肝转移

发表期刊：Phytomedicine

影响因子：11.3

合作单位：南京中医药大学

百趣提供服务：DIA中药入血组

研究背景

结直肠癌是全球重大公共卫生难题，为全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤。其中，结直肠癌肝转移(Colorectal cancer liver metastasis, CRLM)是导致结直肠癌患者死亡的主要原因，其进展不仅取决于肿瘤细胞的内在特性，还依赖于恶性细胞与肝脏肿瘤微环境之间的动态相互作用，促使肿瘤发生免疫逃逸、转移定植和治疗抵抗。因此，鉴定可靶向的分子靶点并开发抑制CRLM的策略是当前研究热点。在中医药干预策略中，仙连解毒汤(Xian-Lian-Jie-Du Decoction, XLJDD)已被证实具有抗结直肠癌活性，可调控肿瘤代谢、改善肠道菌群稳态，具备多靶点调控特征，但该方抑制结CRLM的深层机制尚不清晰，尤其缺少单细胞层面对于细胞骨架重塑及肿瘤微环境调控的阐释。现有研究表明，PLAUR协同EGFR信号调控肌动蛋白骨架重塑，推动肿瘤侵袭转移，有望成为CRLM的治疗靶点。据此，本研究整合转录组学与蛋白质组学分析、单细胞RNA测序、分子对接及多种实验验证手段，系统探讨XLJDD对肌动蛋白细胞骨架重塑及肿瘤微环境重编程的影响，旨在阐明XLJDD靶向抑制CRLM的分子机制，为后续中医药防治提供新靶点与理论支撑。

图形摘要

研究结果

01.XLJDD化学成分分析与质量控制

首先，研究采用UPLC-MS/MS技术对XLJDD颗粒制剂进行色谱分析，共识别注释40个特征色谱峰（图1），明确了该药物颗粒的化学成分图谱。其中，作为本研究后续重点探讨的Plaur靶点结合成分“环黄芪醇(Cyclogalegenin)”被明确识别并标记为特征峰19。

图1.XLJDD颗粒的化学成分分析与质量控制

02.XLJDD可减轻结直肠癌肝转移小鼠模型的肿瘤转移负荷

基于CT26脾脏注射法建立结直肠癌肝转移小鼠模型（图2A），研究发现，XLJDD有着良好的体内抗转移活性，能够显著缓解肝脏转移程度（图2B）、降低肝指数（图2D），并减少肝脏表面转移结节数目（图2E），同时缩小转移病灶范围（图2F），加速肝转移灶肿瘤细胞凋亡（图2G-H），保护肝组织完整且无明显机体毒性（图2C）。这为后续深入开展分子机制研究提供可靠的体内表型基础。

图2.XLJDD能够减轻CT26小鼠结直肠癌肝转移模型的肝脏转移负荷

03.整合转录组学与蛋白质组学分析确Plaur/Hbegf轴为XLJDD的候选靶点

为解析XLJDD抑制结直肠癌肝转移的分子机制，研究对肝脏转移灶组织开展了匹配的转录组学和蛋白质组学分析。结果显示，XLJDD在RNA和蛋白水平上引发了广泛的分子变化（图3A-B）；其中，Hbegf被鉴定为差异分子，而Plaur则被锁定为密切相关的核心候选靶点（图3C），它们之间存在紧密的正相关及功能联系（图3D-E），并且均能被XLJDD显著下调其mRNA及蛋白水平的表达（图3F-I）。基于公共数据库的临床相关性分析显示，PLAUR在结直肠癌组织中的表达显著高于正常组织（图3J），且在转移样本中的表达量较原发肿瘤进一步升高（图3K）；结合生存分析，PLAUR高表达与结直肠癌患者更短的总体生存期密切相关（图3L）。因此，Plaur/Hbegf信号轴可作为XLJDD具备临床意义的候选作用靶点。

图3.整合转录组与蛋白组分析及公共数据集验证，支持Plaur/Hbegf轴作为XLJDD的候选治疗靶点

04.scRNA-seq揭示XLJDD减少Plaur高表达恶性亚群并促进干扰素反应状态

借助scRNA-seq分析，研究开展了单细胞分辨率下XLJDD作用靶细胞及肿瘤微环境变化的解析，其核心结果如下：①针对恶性肿瘤细胞二次聚类，肿瘤细胞显现明显异质性，并划分多个恶性亚群（图4A）；②MiloR差异丰度分析显示，XLJDD能够大范围重塑恶性细胞亚群构成（图4B），减少Car6⁺恶性亚群、增加Ifit1⁺亚群（图4C），而Plaur主要在Car6⁺恶性亚群高表达（图4D）；③透过拟时序分析可知，XLJDD干预促使恶性细胞由终末Car6+状态向Ifit1+状态发生转变（图4E）；④结合单细胞通路评分，XLJDD显著改变肿瘤细胞脂肪酸、糖脂、氨基酸等多条代谢通路活性（图4F），并广泛调控代谢平衡、蛋白稳态及抗原递呈相关通路（图4G）。⑤根据转录因子分析结果，XLJDD显著上调了Stat1、Irf1和Irf7等干扰素相关调控子的活性，肿瘤向着I型干扰素响应状态转化（图4H）。综上，XLJDD在单细胞层面有效削减了Plaur高表达的恶性细胞亚群，并重塑肿瘤细胞向Ifit1+干扰素反应性状态偏移。

图4.scRNA-seq揭示了XLJDD治疗后恶性上皮细胞的异质性及治疗相关的状态转变

05.XLJDD阻断高Plaur恶性细胞与肿瘤相关巨噬细胞间促转移信号交流

为探究XLJDD对肿瘤微环境髓系区室的影响，研究通过scRNA-seq分析发现，XLJDD引发了髓系细胞状态的广泛重塑（图5B），并显著减少了Thbs1+肿瘤相关巨噬细胞(TAM)亚群（图5C）。在该亚群中，Plaur呈相对高表达（图5D），而XLJDD会促使细胞偏离终末Thbs1⁺ TAM状态（图5E）。此外，XLJDD还调控了髓系细胞脂质代谢、氧化磷酸化及干扰素相关转录程序，推动细胞功能重编程（图5F-G）。在细胞间通讯方面，以SPP1为中心的信号在转移微环境中被XLJDD显著削弱，尤其是Spp1-Cd44信号轴，该轴不仅介导了Car6⁺恶性细胞与Thbs1⁺ TAM之间的相互作用（图5H），而且受到肿瘤细胞Plaur活性的调控。因此，XLJDD有效阻断了由肿瘤细胞Plaur活性驱动的Spp1-Cd44促转移串扰。

图5.scRNA-seq揭示了XLJDD诱导的髓系细胞重塑与Car6⁺肿瘤细胞–Thbs1⁺ TAM细胞互作变化

06.Plaur敲低在体外损害结直肠癌细胞的迁移、侵袭及肌动蛋白细胞骨架重塑

通过构建稳定沉默及过表达Plaur的CT26细胞株，研究证实，Plaur的敲低显著抑制了结直肠癌细胞的迁移（图6A-B）与侵袭能力（图6C-D）；同时，存在131个基因均能受Plaur敲低和XLJDD治疗的影响所下调（图6E）。通路富集显示，这些共同下调基因富集于Rho家族GTP酶相关信号，表明Plaur与肌动蛋白细胞骨架动力学及丝状伪足形成密切相关（图6F）。qRT-PCR进一步验证，Arhgef25、Cdc42ep1、Fscn1、Hbegf等靶基因的表达受Plaur调控（图6G）。细胞骨架结构方面，Plaur敲低导致细胞极化减弱且丝状伪足数量显著减少（图6H-I）。此外，公共数据库分析证实，在人结直肠癌组织中PLAUR与FSCN1的mRNA表达呈显著正相关（图6J）。综上，Plaur主要通过调控肌动蛋白细胞骨架重塑来驱动结直肠癌细胞的转移行为。

图6.Plaur可抑制CT26细胞的迁移、侵袭以及肌动蛋白细胞骨架重塑

07.Plaur促进Mmp9相关的Hbegf释放，而XLJDD抑制Egfr/Erk信号通路及细胞骨架效应分子

鉴于Plaur参与细胞周围蛋白水解及生长因子脱落，研究首先证实了Plaur对Mmp9/Hbegf信号轴的调控作用：Plaur的敲低或过表达可显著下调或上调CT26细胞中Mmp9及Hbegf的蛋白表达水平（图7A-C）；同样地，培养上清中分泌型Hbegf的水平也随Plaur的表达量呈现相应的变化趋势（图7D），表明Plaur与Mmp9/Hbegf信号密切相关。随后，XLJDD对体内肝转移组织中下游信号及细胞骨架效应分子的抑制作用被进一步揭示：XLJDD不仅呈剂量依赖性地下调了Fscn1、Arhgef25、Cdc42ep1和Rtkn的mRNA表达（图7E），也显著降低了转移性肝组织中Mmp9、Cdc42ep1和Fscn1的蛋白水平（图7F-I）及EGFR和ERK的磷酸化水平（图7J–M）。综合而言，XLJDD通过抑制Mmp9/Hbegf信号轴及EGFR/ERK通路的激活，进而下调了驱动肿瘤转移的关键细胞骨架效应分子。

图7.Plaur相关Mmp9/Hbegf信号及XLJDD对EGFR/ERK通路与细胞骨架效应分子的抑制作用

08.过表达Plaur可在体内削弱XLJDD的抗转移作用

为验证XLJDD的抗转移作用是否依赖于Plaur的抑制，研究利用对照CT26细胞(NC)和Plaur过表达细胞(Plaur-OE)开展了体内回补实验。结果显示，Plaur过表达组显著削弱了XLJDD的抗转移疗效，加重了肝转移、肿瘤负荷（图8A-C）；在分子与病理层面上，过表达组仍维持较高的Plaur水平，并部分恢复了Hbegf、Fscn1和Cdc42ep1的表达（图8D），造成更广泛的肿瘤浸润与组织破坏（图8E），XLJDD对肿瘤细胞增殖的抑制作用被有效抵消（图8F,I）。同样地，Plaur染色与Fscn1染色也证实，过表达组中Plaur表达在XLJDD处理后仍维持较高水平（图8G,J），XLJDD对该骨架效应蛋白的抑制作用被Plaur过表达显著削弱（图8H,K）。综上，这些结果确证了Plaur是XLJDD发挥抗结直肠癌肝转移作用的关键功能靶点。

图8.Plaur过表达在体内削弱了XLJDD的抗转移效应

09.环黄芪皂醇是XLJDD中一种组织可及的Plaur结合成分，可抑制Plaur表达

基于前文结果，研究接着利用UPLC-MS/MS分析了小鼠血清与肝转移组织中XLJDD入血成分，以筛选靶向Plaur的活性物质。结果显示，萜类和甾体类衍生物为主要吸收成分（图9A-C），来源于XLJDD的多种组成药材（图9D），其中环黄芪皂醇（图9E）、柚皮素等多种成分具备与Plaur结合的潜力。根据良好的组织分布与结合预测，研究最终重点验证了环黄芪皂醇：分子对接显示，其能稳定嵌入Plaur结合口袋，并与ARG-48、GLU-91等关键残基形成相互作用（图9F）；体外实验证实，环黄芪皂醇可呈浓度依赖性地下调CT26细胞中Plaur的mRNA及蛋白表达水平（图9G-I）；靶向定量分析确证，口服XLJDD后，环黄芪皂醇能够有效到达肝转移组织，平均浓度达671.59 ng/g（图9J）。此外，SPR与MST生物物理实验进一步验证了其与Plaur的特异性结合，解离常数Kd为36.74 μM（图9K-L）。综上，环黄芪皂醇是XLJDD中组织可及的Plaur结合成分，且多种吸收成分可能协同介导了对Plaur通路的调控。

图9.环黄芪皂醇是一种可到达靶组织、能够结合Plaur并抑制Plaur表达的活性成分

研究总结

本研究通过整合转录组、蛋白组、单细胞转录组测序及体内外功能实验，系统阐明了仙连解毒汤(XLJDD)抑制结直肠癌肝转移(CRLM)的作用机制。研究发现，XLJDD通过靶向Plaur，抑制Mmp9介导的Hbegf释放，阻断EGFR/ERK信号通路激活，进而下调Fscn1和Cdc42ep1等细胞骨架效应蛋白的表达，从而抑制肌动蛋白细胞骨架重塑和丝状伪足形成，最终削弱肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。单细胞测序进一步揭示，XLJDD可减少Plaur高表达的Car6⁺恶性亚群，促进Ifit1⁺干扰素反应性状态，并削弱恶性细胞与Thbs1⁺肿瘤相关巨噬细胞之间Spp1-Cd44介导的促转移通讯。此外，本研究鉴定出环黄芪醇(Cyclogalegenin)为XLJDD中可直接结合Plaur并抑制其表达的组织可及性活性成分。体内回补实验证实Plaur过表达可显著削弱XLJDD的抗转移效果，并确立了Plaur作为XLJDD发挥抗CRLM作用的关键功能靶点。这些发现为XLJDD治疗结直肠癌肝转移提供了系统的机制解析和明确的药效物质基础，也为中医药现代化研究提供了“靶点清晰、成分明确”的研究范例。