文章标题：Senescent BMSC-Derived Thbs1 Drives Inflammaging and Impairs Bone Regeneration by Suppressing PINK1/Parkin-Mediated Mitophagy in Macrophages

发表期刊：Aging Cell

影响因子：7.7

客户单位：福建医科大学

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研究背景

高龄骨缺损愈合障碍、老年性骨质疏松是重要的公共卫生难题，骨修复能力减退的重要驱动因素是骨髓微环境的炎症衰老。衰老骨髓间充质干细胞(BMSCs)分泌衰老相关分泌表型(SASP)因子，扰乱巨噬细胞M1/M2极化平衡，促炎M1巨噬细胞会抑制骨组织修复。线粒体自噬对维持巨噬细胞功能稳态至关重要，但衰老BMSCs通过何种分泌蛋白破坏该调控机制尚不明确。基质细胞蛋白Thbs1已被报道可调控自噬，然而Thbs1是否介导衰老BMSCs与巨噬细胞之间的异常细胞通讯，仍缺乏直接实验证据。

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研究结果

01.衰老BMSCs分泌组驱动巨噬细胞向M1样表型极化

骨髓微环境呈现炎性衰老是骨骼衰老的重要特征。为解析该现象的细胞基础，本研究分离3月龄年轻雄性大鼠、24月龄老年雄性大鼠的BMSCs及骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)。老年BMSCs的SAβGal阳性率升高（图1a），衰老相关基因Cdkn2a、Cdkn1a、Trp53（图1b）以及p16、p21、p53蛋白（图1cd）表达上调，SASP因子表达增加（图1e）。

为探究衰老BMSCs的旁分泌作用，采用年轻BMSCs条件培养基CM(Y)、老年BMSCs条件培养基CM(A)处理BMDMs 48h。CM(A)上调巨噬细胞M1标志物、下调M2标志物（图1fh）；流式检测结果显示，CD86⁺ M1样巨噬细胞比例升高、CD163⁺ M2巨噬细胞比例降低（图1i）；免疫荧光结果显示M1标志物iNOS信号增强，M2标志物CD206信号减弱（图1j）。同时CM(A)可诱导巨噬细胞发生细胞衰老，SAβGal阳性细胞增多，衰老相关蛋白p53、p21、p16表达上调（图1kl）。综上，衰老BMSCs分泌组能够驱动巨噬细胞向M1样促炎表型极化，并诱导巨噬细胞发生细胞衰老。

图1. 衰老BMSCs分泌组促使巨噬细胞向M1样表型极化

02.衰老BMSCs分泌组损伤巨噬细胞线粒体功能并抑制线粒体自噬

上述结果提示，衰老BMSCs分泌组可介导巨噬细胞促炎表型，但其内在分子机制尚不明确。本研究进一步检测CM(A)对巨噬细胞线粒体的作用。DCFHDA、MitoSOX染色表明，CM(A)可加剧巨噬细胞氧化应激；JC1检测提示CM(A)降低线粒体膜电位（补充图S3a–g）；LC3BTOMM20共定位荧光斑点显著减少，提示线粒体自噬流受抑（补充图S3h）。WB结果显示，CM(A)下调PINK1、Parkin，降低LC3II/I比值，造成自噬底物p62与线粒体蛋白COX IV、TOMM20 累积（补充图S3i）。综上，衰老BMSCs分泌组分可抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，并造成巨噬细胞线粒体功能损伤。

补充图S3. 衰老BMSCs分泌组损伤巨噬细胞线粒体功能并抑制线粒体自噬

03.增强线粒体自噬可挽救线粒体功能障碍并减轻M1样极化与衰老

为验证线粒体自噬缺陷是否为CM(A)促炎效应的关键，本研究使用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl cyanide mchlorophenyl hydrazone, CCCP)激活PINK1/Parkin线粒体自噬，与CM(A)共处理巨噬细胞。CCCP可缓解CM(A)所致总ROS、线粒体超氧化物蓄积，恢复线粒体膜电位（图2ae）；LC3BTOMM20共定位增加，PINK1、Parkin上调，p62与TOMM20蛋白水平降低（图2fg）。功能上，CCCP可部分逆转CM(A)诱导的M1样极化，下调M1标志物、回升M2标志物（图2hj），同时部分减轻巨噬细胞衰老，降低SAβGal阳性率与p16、p21、p53表达（图2kl）。综上，线粒体自噬受抑显著参与CM(A)诱导的巨噬细胞M1样极化及巨噬细胞衰老过程。

图2. CCCP挽救巨噬细胞线粒体功能障碍、恢复线粒体自噬，并减轻M1极化与细胞衰老

04.衰老BMSCs来源的Thbs1抑制巨噬细胞线粒体自噬并驱动M1样极化

明确线粒体自噬缺陷的关键作用后，本研究继续探寻上游驱动分子。对年轻、老年BMSCs开展RNAseq，结合胞外基质、免疫及衰老基因交集分析，筛选得到上调的核心分泌分子Thbs1（图3ab）。敲低BMSCs的Thbs1后，条件培养基CM(siThbs1)可下调巨噬细胞M1样标志物、上调M2标志物，CD86⁺细胞减少、CD163⁺细胞增多；重组Thbs1蛋白(recombinant Thbs1, rThbs1)回补可逆转上述保护表型（图3ch）。线粒体检测表明，Thbs1敲低可减少线粒体超氧化物（图3i），增强LC3BTOMM20共定位（图3j）；WB检测可见PINK1、Parkin表达升高，rThbs1回补再次抑制线粒体自噬（图S7g）。综上，衰老BMSCs分泌的Thbs1是抑制巨噬细胞线粒体自噬、诱导M1样极化的核心分子。

图3. 衰老BMSCs来源的Thbs1可抑制巨噬细胞线粒体自噬并驱动M1样极化

05.Thbs1通过TGF-β/Smad3信号抑制线粒体自噬并驱动巨噬细胞M1样极化

明确Thbs1的核心作用后，该研究进一步解析其下游分子信号通路。免疫共沉淀实验证实Thbs1能够结合巨噬细胞表面受体Tgfbr2（补充图S8a–b）；CM(A)刺激可显著上调Smad3磷酸化水平，敲低Thbs1能够阻断这一活化效应（补充图S8c）。外源性rThbs1直接刺激巨噬细胞可诱导Smad3磷酸化；敲低Tgfbr2（补充图S8dh）或采用Smad3特异性抑制剂SIS3干预（补充图S10a），均可阻断rThbs1介导的Smad3激活，同时逆转巨噬细胞M1极化、线粒体损伤及线粒体自噬受抑的表型。综上，Thbs1通过激活TGFβ/Smad3信号通路，抑制巨噬细胞线粒体自噬，进而促进M1样极化。

补充图S8：Thbs1通过结合巨噬细胞上的Tgfbr2激活TGF-β/Smad3信号通路

06.Smad3核转位直接结合Pink1启动子抑制其转录

为进一步揭示Smad3抑制线粒体自噬的分子机制，该研究检测Smad3的亚细胞定位。rThbs1刺激促进Smad3磷酸化并发生核转位；敲低Smad3可显著上调Pink1的mRNA与PINK1蛋白水平。生物信息学预测Pink1启动子存在3个Smad3结合位点；染色质免疫沉淀实验证实，Smad3特异性结合位点1(−982bp)，rThbs1处理能够增强Smad3在该位点的结合，进而下调Pink1转录（图4aj）。综上，Thbs1激活Smad3入核，直接结合Pink1启动子抑制其转录，进而阻断线粒体自噬。

图4. Thbs1诱导Smad3入核，抑制Pink1转录，阻断线粒体自噬

07.M1样巨噬细胞经IL-6/JAK/STAT3反馈环路抑制成骨分化

虽已明确Thbs1诱导巨噬细胞向M1样极化的分子机制，但该炎症信号对BMSC成骨的反向调控效应仍有待阐明。该研究体外证实，Thbs1激活的M1样巨噬细胞条件培养基可下调BMSC成骨相关基因Alpl、Runx2、Spp1，并抑制ALP活性与基质矿化能力（图5ae）。敲低BMSC的Thbs1能够减少巨噬细胞IL6的分泌（图5g），减轻成骨抑制现象；rThbs1回补后又重新出现成骨抑制表型（图5f）。IL6中和抗体或者JAK抑制剂鲁索替尼处理，可阻断STAT3磷酸化，解除上述成骨抑制效应（图5hp）。综上，经Thbs1诱导极化的M1样巨噬细胞分泌IL6，通过激活BMSC的JAK/STAT3信号通路进而抑制其成骨分化。

图5. Thbs1诱导M1型巨噬细胞释放IL-6，经JAK/STAT3环路抑制BMSC成骨

08.Stat3转录激活Thbs1形成正反馈

上述反馈提示Thbs1与IL6/STAT3存在正向调控。转录组分析显示Thbs1为炎症衰老交集唯一持续上调基因（补充图S17a），生物信息学预测Thbs1启动子存在Stat3结合位点（补充图S17bc）。M1样巨噬细胞条件培养基处理BMSCs，可提升Stat3磷酸化并促进Thbs1表达与分泌（补充图S17de）；敲低BMSCs的Stat3则下调Thbs1的mRNA与蛋白（补充图S17fh）。染色质免疫沉淀证实，Stat3直接结合Thbs1启动子位点3（补充图S17i）。综上，活化的Stat3在转录水平激活Thbs1，形成 “Thbs1→M1→IL6→STAT3→Thbs1” 自我放大的炎症正反馈环路。

补充图S17. Stat3转录激活Thbs1，维持衰老BMSCs促炎反馈环路

09.AAV9介导Thbs1敲低改善老年大鼠颅骨骨缺损修复

为在体内验证Thbs1作为治疗靶点的价值，该研究使用24月龄老年大鼠建立颅骨临界骨缺损模型，设置AAV9shNC阴性对照、AAV9shThbs1敲低组以及rThbs1回补组。局部给予AAV9病毒处理4周后，构建5 mm颅骨缺损，术后1个月收取样本进行检测。Thbs1敲低能够减轻巨噬细胞氧化应激损伤、恢复线粒体自噬水平，推动巨噬细胞由M1向M2表型转换（图6ab）；补充外源rThbs1可逆转上述保护效应。MicroCT以及组织学检测结果显示，沉默Thbs1可改善骨相关计量参数，促进新生骨生成、胶原沉积并提升矿化速率（图6cl）。综上，靶向下调Thbs1能够恢复巨噬细胞线粒体自噬，重塑巨噬细胞极化平衡，进而促进老年大鼠颅骨缺损的骨再生。

图6. AAV9介导的Thbs1敲低可重编程巨噬细胞，从而改善老年大鼠的骨再生能力

研究小结

该研究解析衰老骨髓微环境抑制骨再生的机制，经转录组筛选发现衰老BMSC分泌的Thbs1为核心SASP因子。Thbs1结合巨噬细胞Tgfbr2，激活Smad3通路，Smad3入核转录抑制Pink1，阻断线粒体自噬，诱发氧化应激并促使巨噬细胞M1样极化；M1样巨噬细胞分泌IL6，激活BMSC的JAK/STAT3通路，在抑制成骨分化的同时上调Thbs1，形成促炎正反馈环路。大鼠颅骨缺损体内试验证实，敲低Thbs1可修复巨噬细胞线粒体功能、平衡巨噬细胞表型，促进骨再生。该研究证明Thbs1介导的恶性循环是老年骨修复障碍的关键，为老年骨相关疾病提供新的治疗靶点。