代谢biomarker筛选是疾病早期筛查和预后评估的重要手段，一组有效的代谢Biomarker筛选是一个漫长且艰难的过程。从临床样本的选择、队列分组到实验思路设计再到大量的数据分析均是生物标志物筛选缺一不可的关键环节。到底应该如何筛选并对临床样本进行分组？如何设计严谨的筛选-验证实验？如何评估标志物的诊断效能？本期我们选择5篇临床biomarker筛选文章，看完这个系列，相信以上问题都会迎刃而解。
临床biomarker专题
文章1. 增强HBV-ACLF预后的生物标志物筛选
文章2. 频发型与偶发型痛风患者的血清代谢标志物新发现
文章3. 结直肠癌的基于菌群和血清代谢物的诊断模型建立
文章4. 脂质组学生物标志物:尿双酚A暴露与结直肠癌之间的潜在介质
文章5. 肝细胞癌早期检测的大规模、多中心血清代谢物生物标志物鉴定
文献解读 | (IF=25.7)增强HBV-ACLF预后的生物标志物筛选
急性伴慢性肝功能衰竭(Acute-on-chronic liver failure, ACLF)是慢性肝病患者短期死亡率高的临床综合征，主要表现为慢性肝病或肝硬化患者的急性肝功能障碍。慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, HBV)是ACLF 的主要原因。目前ACLF尚无有效的治疗方法，为了改善ACLF患者的疾病管理和生存，旨在发现新的生物标志物来提高HBV-ACLF的诊断和预后的准确性。
图1.实验设计
该研究共有1024个患者，其中367人患有ACLF（127例未存活，240例在入院90天内存活）；657人为非ACLF患者（135例在住院期间发展为ACLF，522例病情稳定）。
总结HBV-ACLF和非ACLF患者入院时的关键临床参数，其中，HBV的免疫状态标记物（HBeAg和HBeAb）无显著性差异，HBV-ACLF患者器官衰竭比例显著增加，TB、ALT、AST、肌酸、INR指标水平升高，MELD-Na和CLIF-C ACLF评分较高。非幸存者的TB，INR，CPR，MELD-Na和CLIF-C ACLF的评分高于幸存者。ACLF前患者的TB，INR和MELD-Na的评分高于稳定的非ACLF前患者（全称见注解）。
注解（总胆红素(total bilirubin, TB)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、肌酸、国际标准化比率(International normalized ratio, INR)、C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)，终末期肝病肝硬化评分模型(Model for End-Stage Liver Disease score for liver cirrhosis, MELD-Na)，欧洲慢性肝衰竭研究基金会-急性伴慢性肝功能衰竭(CLIF-C ACLF)）
图2. 研究流程图
将发现集的512例样本进行非靶检测，共鉴定出1072种物质，其中有715种差异代谢物（图3 A），分别影响了脂质、氨基酸、外源性物质、核苷酸、辅助因子和维生素、碳水化合物、多肽、部分表征分子和能量代谢等途径（图3 B），主要影响了肝脏的代谢功能、类固醇激素、胆汁酸重吸收和胆红素清除受损、炎症和氧化应激升高、肠道菌群、细胞和组织损伤和能量代谢等生理功能（图3 C）。
图3. HBV-ACLF改变的血浆代谢组学特征
将ACLF样本随机分成相等的两部分（120名幸存者和64名非幸存者组成发现集，120名幸存者和63名非幸存者组成验证集）用于预测HBV-ACLF 90天死亡率的代谢生物标志物。幸存者组和非幸存者组共有270种差异代谢物（FDR<0.05）（图4 A）。利用随机森林对代谢物进行排序，与错误发现率(False discovery rate, FDR)排名最高的代谢物在很大程度上重叠（图4 B），根据t检验/随机森林排名前50的代谢物进行靶向分析，得到31种差异代谢物，根据逻辑回归模型分析发现哌啶酸盐(pipecolate)、N-乙酰-天冬氨酸-谷氨酸(N-acetyl-aspartyl-glutamate, NAAG)和丙酸脲(ureidopropionate)为一个诊断模型，这个模型在发现集和验证集预测ACLF 90天死亡率的曲线下面积(area under the curve, AUC)分别为0.79和0.71（图4 C-D）。
图4. HBV-ACLF 90天死亡率相关的代谢物生物标志物的确定
将657例样本（67个前ACLF样本和261个非ACLF样本组成发现集，68个前ACLF样本和261个非ACLF样本组成验证集）用于预测HBV-ACLF诊断前代谢物生物标志物，其中前ACLF样本和非ACLF样本共有290种差异代谢物（FDR< 0.05）（图5 A）。使用与鉴定ACLF 90天死亡率生物标志物类似的方法，发现两种代谢物(pipecolate和γ-羧乙基羟色胺(γ-carboxyethyl hydroxychroman, γ-CEHC))的诊断模型（预测HBV-ACLF诊断前的代谢物生物标志物）。这个模型在发现集和验证集预测ACLF诊断前的AUC分别为0.79和0.74（图5 C-D）。
图5. 确定HBV -ACLF诊断前相关的代谢物生物标志物
本研究开发了一种基于LC-MS的多重靶标法用于预测ACLF 90天死亡率和ACLF诊断前代谢物的四种代谢生物标志物(γ-CEHC 、NAAG、pipecolate、ureidoproonate)的绝对定量。
利用三代谢物模型(pipecolate, NAAG, ureidoproonate)重新评估了ACLF 90天死亡率的预后表现，该模型在发现集和验证集的AUC分别为0.80和0.74（图6 A-B），高于非靶代谢组学的AUC结果。使用逻辑回归，将临床指标（年龄、INR、肌酸、钠、白蛋白等）添加到三代谢物模型中，其模型的AUC增加到0.87，高于CLIF-C ACLF(AUC 0.79)、MELD-Na(AUC 0.78）和单独代谢物模型（图6 A），同时在验证集中也得到同样的结论(AUC 0.83)（图6 B）。
利用双代谢物模型（pipecolate和CEHC）评估ACLF诊断前的准确性，双代谢物模型在发现集和验证集的AUC分别为0.86和0.77（图6 C-D）。在模型中加入TB、INR和有无肝硬化指标，最终模型的AUC在发现集中增加到0.94，显著高于CLIF-AD(AUC 0.52)、CLIF-C ACLF-D(AUC 0.61)、MELD-Na(AUC 0.88)和单独的代谢组（图6 C）,验证集中的也得到了类似的结论(AUC 0.88)（图6 D）。
图6. HBV-ACLF 90天死亡率预后及ACLF诊断前模型的诊断性能分析
1.本研究共招募1024名患者，其中367人患有ACLF；657人为非ACLF患者；
2.利用LC-MS非靶向和自行开发的LC-MS靶向分析方法进行组学检测分析；
3.利用机器学习和统计分析的方法建立了预测ACLF 90天死亡率的三代谢物模型(pipecolate, NAAG, ureidoproonate)和ACLF前诊断的双代谢物模型（pipecolate和CEHC）；
4.总的来说为了将发现转化为实际的临床试验，作者开发了LC-MS的靶向分析方法，基于新的代谢物生物标志物，建立了比现有方法更高准确性的HBV-ACLF检测方法。
