英文标题：De novo biosynthesis of plant lignans by synthetic yeast consortia
发表期刊：nature chemical biology
影响因子：13.7
客户单位：中国人民解放军海军军医大学
百趣提供服务：600MRM（现已升级为AQ700）
研究背景
由合成生物学驱动的微生物代谢工程是生产植物天然产物的可行方法，但异源重建复杂代谢途径仍面临挑战，如代谢混杂、副反应和代谢负担，导致复杂分子产量低。植物通过多细胞分工合成复杂天然产物，受此启发，假设酵母联合体可以像植物细胞一样进行分工以防止副反应，并在酿酒酵母中实现木脂素的从头合成（图1）。
木脂素是一类结构多样的天然产物，其合成始于松柏醇，涉及多步酶反应。在微生物中合成松柏醇是生产木脂素的关键，但异源途径易受代谢干扰，尤其是中间体易被混杂酶转化。为解决这一问题，本研究利用营养缺陷型酵母(met15Δ和ade2Δ)构建互惠共生联合体，分工合成松柏醇：一株负责生产阿魏酸，另一株转化为松柏醇及其衍生的木脂素。该策略有效减少了副反应，并成功合成了多种木脂素（如松脂醇、LDG等）。
这一研究证明，酵母联合体可模拟植物细胞分工，优化复杂天然产物的合成，并为其他天然产物的微生物生产提供了新思路。
图1 在具有专性互惠的酵母联合体中从头合成木脂素糖苷的工程生物合成设计
技术路线
研究结果
01.松柏醇在酵母中的生物合成
松柏醇是木脂素合成的关键前体，但其选择性合成受复杂代谢网络限制。为优化酿酒酵母中的松柏醇合成，研究测试了三种芳香酸（对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸）作为底物，结合芳香醇模块（图2a）。尽管大肠杆菌中可通过FADH2依赖的单加氧酶和甲基转移酶将对香豆酸转化为松柏醇，但酵母中该途径无效，且未检测到芳香醛或醇产物，推测可能生成酰基辅酶A衍生物。引入甲基转移酶也未成功。
相比之下，阿魏酸可被工程菌株(如RB57)高效转化为松柏醇(图2b)。然而，直接在阿魏酸生产菌株(RB79)中引入芳香醇模块未能合成松柏醇，表明4CL的混杂活性（可作用于对香豆酸、咖啡酸）导致前体分流。
为解决这一问题，研究设计了一个双酵母联合体系统：一株(RB218)负责阿魏酸合成并分泌至培养基，另一株(RB57)摄取阿魏酸并转化为松柏醇。共培养成功合成1.2 mg/L松柏醇（图2c），证明分工策略可减少副反应，但产量波动表明需进一步优化联合体稳定性。
图2 酵母中松柏醇生物合成途径的筛选与构建
02.通过酵母群促进生物合成
为优化酵母联合体的代谢分工性能，研究筛选了11种营养缺陷型突变体，最终选择生长速率最高的met15Δ-ade2Δ配对作为最佳组合（图3a-b）。该配对排除了完全培养基对种子菌液引入缺陷化合物的干扰，在液体培养中表现出严格依赖交叉喂养的专性互惠关系（图3c）。代谢分析显示，蛋氨酸、腺嘌呤及其衍生物（如半胱甘肽、腺苷、肌苷）是维持共生的关键交叉喂养物质（图3d）。
进一步构建两种反向联合体（RB218met15Δ-RB57ade2Δ和RB218ade2Δ-RB57met15Δ），发现交叉喂养方向显著影响生长和松柏醇产量（图3e-f）。并且RB218met15Δ-RB57ade2Δ联合体表现更稳定，合成松柏醇，表明代谢通路表达差异影响联合体性能。
研究推测，将met15Δ缺陷引入生长较慢的菌株(RB218)更易通过交叉喂养维持稳定性。这一发现为优化合成生物学中的微生物分工提供了重要参考。
图3 具有专性互惠的酵母菌群中针叶醇的从头生物合成
03.松脂醇和落叶松脂醇在酵母中的生物合成
为合成木脂素关键骨架，研究基于酵母联合体的松柏醇从头合成，探索了下游途径（图4a）。首先测试了漆酶(Lac)和过氧化物酶(Pex)催化松柏醇偶联反应，但初始尝试（如CgL1、YfeX截短体PEX1tr）在酵母中无效。最终，去除信号肽的真菌漆酶TsLAC3tr成功将阿魏酸转化为松脂醇（图4b），但底物过量时副反应增多。
为优化区域选择性，研究引入菘蓝来源的定向蛋白(IiDir1/IiDir2及其截短体)，通过调控β-β' 键的区域和对映选择性，有效减少了副反应（图4c）。其中，细胞质共表达的IiDir1tr使松脂醇产量从7.9 mg/L提升至19.1 mg/L，并偏好合成(−)-松脂醇。随后，通过表达拟南芥(AtPRR1)和靛蓝(IiPLR1)的松脂醇还原酶(Plr)，成功将松脂醇转化为落叶松脂醇（图4d），并检测到微量二异松脂醇。
该研究建立了酵母中高效合成松脂醇和落叶松脂醇的途径，为复杂木脂素生产奠定了基础。
图4 酿酒酵母木脂素生物合成的构建与优化
04.酵母中复合木脂素糖苷的生物合成
为合成抗病毒木脂素苷LDG，研究在松脂醇生产菌株XH2B2中引入三个菘蓝来源的UGT糖基转移酶(IiUGT71B2/B5a/B5b)。
结果显示，仅IiUGT71B5b(XH12)能在酵母中催化生成LDG（图5a），通过多拷贝表达该基因并强化UDP-葡萄糖前体（过表达PGM1和UGP1），产量提升217%；所有UGTs均能催化松脂醇单/二葡萄糖苷生成（图5b），但偏好性不同：IiUGT71B2(XH13)和IiUGT71B5b(XH9B1)倾向合成单糖苷；IiUGT71B5a(XH8B1)更高效合成二糖苷。
该研究通过酶挖掘、亚细胞定位优化及自由基偶联调控，实现了以阿魏酸为底物的木脂素苷微生物合成。
图5 酿酒酵母木脂素糖苷的生产
05.酵母菌群合成木脂素糖苷的研究
最后，构建了一个用于抗病毒LDG从头合成的酵母联合体，这为缓解酚酸下游途径的代谢混杂提供了一个有益的共生系统（图6a）。将抗病毒木脂素(LDG)的合成途径分为两部分：RB218菌株负责合成阿魏酸，XH12菌株将阿魏酸转化为LDG。通过营养缺陷型互补(met15Δ-ade2Δ)强制共生（图6b），优化菌株比例（5:1）后，摇瓶培养中LDG产量达2.6±1.4 μg/L，前体松脂醇单葡糖苷产量为7.6±2.5 μg/L（图6c）。
在生物反应器补料分批发酵中，通过荧光标记监测菌群动态（比例从5:1变为3:7）（图6d），最终LDG产量提升至17.8±11.8 μg/L，松脂醇单葡糖苷达63.1±21.3 μg/L（图6e）。该体系验证了代谢分工共生策略在复杂天然产物合成中的可行性。
图6 具有专性互惠作用的酵母联合体中抗病毒木脂素糖苷的从头生物合成
研究小结
植物提取仍是木脂素的主要来源，但效率低且受限于转基因植物的法规限制，微生物合成成为替代方案，但单菌株面临代谢紊乱、副反应等问题。
本研究利用酵母联合体(RB218和XH12菌株)分工合成抗病毒木脂素(LDG)，通过营养缺陷互补(met15Δ-ade2Δ)强制共生，优化菌株比例（5:1）后，摇瓶培养中LDG产量达2.6 μg/L。
在生物反应器中，菌群比例动态变化（比例从5:1变为3:7），最终LDG产量提升至17.8 μg/L。该体系通过多细胞分工模拟植物代谢，减少代谢干扰，为复杂天然产物合成提供了新策略。
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