文章标题：Veillonella intestinal colonization promotes C. difficile infection in Crohn’s disease

发表期刊：Cell Host & Microbe

影响因子：18.7

客户单位：上海交通大学医学院附属仁济医院

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

克罗恩病是一种常见的炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）。临床表现包括腹痛、腹泻、肠梗阻等。它与 IBD 的另一种主要类型溃疡性结肠炎不同，通常影响整个消化道，引起间歇性而不是持续性炎症。除了手术切除受影响的肠道部分外，没有其他治疗方法，术后复发很常见。

虽然肠道菌群失调是包括克罗恩病在内的 IBD 的一个关键特征，但 IBD 和克罗恩病中宿主-微生物群相互作用的机制才刚刚开始被揭示，并且主要集中在免疫反应上。

特定微生物如何影响 IBD 环境中的其他微生物，进而导致 IBD 或感染，在很大程度上仍然未知。肠道菌群失调通常由抗生素治疗引起，已知是艰难梭菌感染（Clostridioides difficile Infection, CDI）的主要风险因素，CDI 是发达国家最致命的抗菌素耐药性相关疾病。

研究结果

01-韦荣球菌与克罗恩病患者 CDI 的发生和严重程度有关

为了研究克罗恩病患者肠道微生物群与 CDI 发展之间的潜在关系，作者首先分析了公开可用的宏基因组数据。在该分析中，作者纳入了 17 例 CDI 合并 IBD 患者和 224 例 IBD 对照患者的数据（而不仅仅是克罗恩病），因为克罗恩病期间 CDI 相关数据的可获得性较低。

结果显示，两组菌群的 α-多样性和 β-多样性均存在显著差异，其中 IBD+CDI 组中富集最显著的物种是两种 Veillonella 属细菌 ——V. parvula（小韦荣氏球菌）和 V. dispar（殊异韦荣氏球菌）（图 1C）。韦荣氏球菌属的成员是口腔共生菌，偶尔参与口腔疾病，其肠道异位定植可能参与肠道炎症进程，且先前在微生物组研究中已被证实与 IBD、克罗恩病和溃疡性结肠炎相关。

随后，作者对 88 例克罗恩病患者进行了前瞻性观察研究，其中 35 例患有 CDI（图 1D）。结果显示，Veillonella 的相对丰度与表示疾病严重程度的克罗恩病活动指数（CDAI）存在显著正相关（图 1H）。

图1. 韦荣氏球菌与克罗恩病患者艰难梭菌感染（CDI）的发生及严重程度相关

02-小韦荣氏球菌（V. parvula）加重结肠炎模型中 CDI 的严重程度

作者采用 DSS/TNBS 诱导的结肠炎小鼠模型（图 2A），同时设置非结肠炎对照模型，并以大肠杆菌、脆弱拟杆菌为对照以验证作用特异性，借助 qPCR、组织学分析等技术检测相关指标。

结果显示，V. parvula 仅在肠道炎症背景下发挥作用：在非结肠炎模型中，既无法诱导 CDI 发生，也不能升高疾病评分；而在结肠炎模型中，V. parvula 经灌胃后肠道定植量显著增加（图 2B），不仅能通过升高粪便艰难梭菌 CFU 数量、提高疾病活动指数（DAI）评分以加重 CDI 发病进程（图 2C-E），还可诱导肠道组织中肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）的基因表达（图 2F-G）及 TNF-α 蛋白水平升高（图 2H），进而加剧肠上皮损伤，表现为炎症细胞浸润增多、杯状细胞丢失、隐窝脓肿等病理改变（图 2I）。

该促 CDI 及炎症效应具有 V. parvula 特异性，大肠杆菌、脆弱拟杆菌均无此作用（图 2J-O）；此外，V. parvula 在抗生素治疗后仍保持较强的肠道定植持久性（图 2Q），可显著增加 CDI 复发（rCDI）风险（图 2R-S）。

图2. 在肠道炎症动物模型中，小韦荣球菌增加 CDI 的严重程度

03-小韦荣球菌刺激艰难梭菌在小鼠发炎的肠道中萌发

在 DSS/TNBS 诱导的结肠炎小鼠模型中（非炎症模型无此生物学效应），作者采用双荧光标记追踪体系：以异硫氰酸荧光素（FITC）特异性标记艰难梭菌休眠孢子，以 Cy5ADA 染料靶向染色萌发后具有代谢活性的艰难梭菌营养细胞。结合流式细胞术定量分析与共聚焦显微镜可视化观察盲肠内容物，结果显示，V. Parvula 定植组的艰难梭菌孢子萌发率显著升高（图 3A-C）。

该萌发促进效应具有 V. parvula 特异性，大肠杆菌、脆弱拟杆菌对照组未观察到类似表型（图 3D-E）；体外功能验证进一步证实，V. parvula 定植小鼠的盲肠内容物及克罗恩病合并 CDI 患者的粪便样本，均能显著增强艰难梭菌孢子的体外萌发能力（图 3F-G）。机制上，该效应通过 V. parvula 介导的肠道内胆汁酸积累实现，进而增加克罗恩病患者 CDI 的发生风险。

图3. 小韦荣球菌刺激艰难梭菌在小鼠发炎的肠道内萌发

04-在克罗恩病患者和小鼠结肠炎模型中，韦荣球菌与胆汁酸代谢和浓度增加有关

为阐明 CDI 相关肠道微生物组促进克罗恩病患者艰难梭菌萌发的潜在机制，作者对 22 例克罗恩病患者、25 例克罗恩病合并 CDI 患者的粪便样本进行代谢组学分析。结果显示，两组差异最显著的代谢物为胆汁酸（含胆酸、牛磺结合型胆汁酸等）（图 4C）；通路富集分析中，胆汁分泌、原发性胆汁酸生物合成通路显著富集（图 4D）；Spearman 相关性分析证实，韦荣球菌丰度与多种胆汁酸的含量呈显著正相关（图 4E）。

为验证上述关联，作者构建小鼠 DSS 结肠炎模型，对盲肠内容物进行代谢组学检测。结果显示，小韦荣球菌（V. parvula）接种组与对照组代谢组存在显著差异（图 4F-G），其中多种胆汁酸水平升高最显著；通路分析可见，初级胆汁酸合成、胆汁分泌及牛磺酸 / 次牛磺酸代谢通路均显著上调（图 4I），与临床患者样本的代谢组变化高度一致（图 4C-E）。

机制上，韦荣球菌通过抑制肠道胆汁酸转运蛋白 ASBT 的表达，减少胆汁酸再吸收，导致肠道内胆汁酸异常积聚，进而为艰难梭菌萌发提供必要信号。

图4. Veillonella 与克罗恩病患者和小鼠结肠炎模型中胆汁酸代谢和浓度增加有关

05-V.parvula抑制负责回肠胆汁酸重吸收的主要转运蛋白的表达

作者先假设 V. parvula 通过促进胆汁酸合成增加肠道胆汁酸浓度，但实验显示：DSS 模型小鼠肝组织中胆汁酸合成相关酶的核心编码基因未被显著上调，TNBS 模型中仅 2 个相关基因表达略高，该假设未成立。

随后提出核心假设：V. parvula 通过抑制胆汁酸重吸收发挥作用（胆汁酸重吸收主要依赖回肠的根尖钠依赖性胆汁酸转运体 ASBT，其功能在克罗恩病患者中已降低）。

验证实验证实：V. parvula 在小鼠结肠炎模型的回肠中富集（图 5A-B），且诱导回肠组织炎症（图 5C）；V. parvula 显著增加肠道内总胆汁酸及共轭型胆汁酸（如牛磺胆酸 TCA）浓度（图 5D-F），荧光标记 TCA 排泄实验证实其重吸收受阻（图 5J）；RT-qPCR 和免疫组化检测显示，V. parvula 显著抑制回肠组织中 ASBT 的基因和蛋白表达（图 5K-L）。综上，V. parvula 通过抑制 ASBT 表达，损害回肠对胆汁酸的重吸收，导致盲肠胆汁酸积聚，进而促进艰难梭菌孢子萌发。

图5. V. parvula 抑制负责回肠胆汁酸重吸收的主要转运蛋白的表达

06-V.parvula诱导炎症信号通路和 c-Jun/c-Fos 表达

为阐明 V. parvula 抑制 ASBT 的分子机制，作者以分化后可形成肠上皮样单层结构的 Caco-2 细胞系为模型，通过全基因组 RNA 测序、RT-qPCR 及 western blot 等技术，探究 V. parvula 对细胞基因表达的影响。

全基因组分析表明，V. parvula 处理后，炎症相关基因及信号通路显著上调（图 6A-B），同时 ASBT 基因和蛋白表达水平显著降低（图 6C-D）；炎症细胞因子 TNF-α 的基因表达显著升高，证实细胞存在炎症激活（图 6E）；c-Jun 和 c-Fos 基因表达显著上调（图 6F-G），二者共同构成 AP-1 早期反应转录因子，且已有研究证实 C-Fos 参与炎症诱导的 ASBT 表达调控。

综上，V. parvula 通过激活肠上皮细胞的炎症信号通路，上调 c-Jun/c-Fos 转录因子表达，进而介导 ASBT 表达抑制。

图6. V. parvula 诱导炎症信号通路和 c-Jun/c-Fos 表达

07-V.parvula LPS具有强烈的促炎特性，刺激 ASBT 调节信号通路

为阐明 V. parvula 介导 c-Fos/c-Jun 依赖的 ASBT 抑制的关键细菌因子，作者采用 Calatayud 等人开发的简化版回肠宿主-微生物组 transwell 模型（图 7A），将 Caco-2 肠上皮样细胞接种于上层小室、THP-1 巨噬细胞样细胞接种于下层小室，通过检测 ASBT、TNF-α 及 IL-1β 的表达，对比完整 V. parvula 与无细胞培养上清液的活性（图 7B-D）。

结果显示，完整细菌的活性显著高于上清液，提示核心活性分子为细菌表面相关分子——革兰氏阴性菌 V. parvula 的关键表面促炎分子为脂多糖（LPS）。

进一步分离 V. parvula 的 LPS，与脆弱拟杆菌（B. fragilis）、大肠杆菌的 LPS 对比分析：V. parvula LPS 可显著抑制 ASBT 表达，同时诱导 c-Fos、c-Jun、FOSB 及 IL-1β 表达，且能上调 TLR4 受体表达（图 7E-J）；

Western blot 验证显示，V. parvula LPS 可激活 MEK/ERK 信号通路，促进 c-Fos、c-Jun 磷酸化（图 7K），进而抑制 ASBT 表达并减少牛磺胆酸（TCA）的跨上皮转运（图 7L）。

加入 c-Fos/AP-1 特异性抑制剂（T5224）后，V. parvula LPS 对 ASBT 转录及蛋白水平的抑制效应显著减弱（图 7M-N），证实该调控依赖 c-Fos 介导的信号通路。

鉴于 V. parvula 的肠道异位定植依赖硝酸盐代谢能力，作者探究其对细菌功能的影响：V. parvula 可高效将硝酸盐代谢为亚硝酸盐（大肠杆菌该能力较弱，脆弱拟杆菌无此能力，图 7O）；脆弱拟杆菌的基础粘附能力最强，但硝酸盐可显著增强 V. parvula 对肠上皮细胞的粘附能力（图 7P），进而促进其定植及 LPS 介导的 ASBT 抑制效应。

综上，V. parvula 通过 “LPS 介导的促炎信号通路激活” 与 “硝酸盐增强的肠道粘附定植能力” 协同作用，最终抑制 ASBT 表达，减少胆汁酸重吸收。

图7. V. parvula LPS 具有强烈的促炎特性，可刺激 ASBT 调节信号通路

研究总结

本研究阐明克罗恩病与 CDI 的关联机制：小韦荣球菌（V. parvula）肠道定植与克罗恩病患者 CDI 发生、严重程度及复发密切相关。其通过表面 LPS 激活 TLR4-MEK/ERK 通路，诱导 c-Jun/c-Fos 表达，抑制胆汁酸转运蛋白 ASBT，导致肠腔胆汁酸（如 TCA）积聚，进而促进艰难梭菌孢子萌发，最终加剧 CDI。

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