文章标题：Investigation of novel metabolites generated by Torulaspora delbrueckii to promote the aroma biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation
发表期刊：LWT-Food Science and Technology
影响因子：6.6
合作单位：天津科技大学
合作产品：新一代代谢组学NGM 2 Pro
研究背景
葡萄酒发酵是复杂的微生物过程，多种微生物协同将葡萄糖转化为乙醇并生成影响葡萄酒品质的次级化合物，其中酿酒酵母（S. cerevisiae）因生长速率高、糖代谢彻底及乙醇耐受性强成为酿酒常用酵母，而戴尔有孢圆酵母（T. delbrueckii）等非酿酒酵母能产生酿酒酵母所没有的更高水平挥发性酯、萜烯及酶类，二者混合发酵已成为提升葡萄酒风味和感官品质的重要策略。但混合发酵中的生物因素（如细胞接触、群体感应）与非生物因素（如温度、氧气）使葡萄酒香气增强机制难以阐明，且目前关于酵母代谢物提升葡萄酒香气品质的信息有限，此前虽有研究用双室发酵罐（允许代谢物交换但阻止细胞接触）探究酵母代谢物对混合发酵葡萄酒香气的影响，且前期研究发现酿酒酵母和戴尔有孢圆酵母的代谢物能提升最终葡萄酒中丁酸乙酯、癸酸乙酯等物质浓度，但尚不明确具体哪种化合物或酵母起作用。
因此，本研究以戴尔有孢圆酵母代谢物对酿酒酵母香气合成的影响为核心，通过细胞/培养基分离策略，结合葡萄酒发酵过程中挥发性成分动态变化测定、转录组学及非靶标代谢组分析开展研究。
本文旨在明确戴尔有孢圆酵母代谢物对酿酒酵母香气合成的作用，深入理解挥发性物质形成机制，为酿酒师在酿酒过程中有效调控香气特征提供有价值的见解。
实验设计
图1. 实验设计示意图
研究结果
01 - 葡萄酒中的基础参数与香气成分
为了明确 T. delbrueckii 代谢物对 S. cerevisiae 发酵终产物核心品质指标的影响，采用 HPLC 测定 S. cerevisiae （SC）、S. cerevisiae 接种 T. delbrueckii 24h/48h 无细胞上清组（ST24/ST48）中糖、甘油、有机酸等基础参数。结果如表1所示，相对 SC 组，琥珀酸显著升高，乳酸和苹果酸显著降低，ST48 组的乙酸显著降低；而柠檬酸、酒石酸、糖、甘油和乙醇在三组间无显著性差异。
使用 HS-SPME-GC-MS 技术测定 13 种主要挥发性香气物质。结果显示，相对 SC 组，乙酸异戊酯显著升高，而 2-苯乙醇乙酸酯显著降低；ST24 组的辛酸乙酯、癸酸乙酯显著升高，在 ST48 组呈相反趋势，且乙酸乙酯、丁酸乙酯无显著性差异。异戊醇在 ST24 组无差异，而在 ST48 组显著升高；异丁醇、2-苯乙醇在三组间无显著差异。ST48 组的己酸、辛酸、癸酸显著降低。
这表明 T. delbrueckii 代谢物不影响 S. cerevisiae 发酵最终葡萄酒的残糖、甘油及乙醇含量，但会改变有机酸组成，且其不同发酵时长代谢物对香气合成有 “时序特异性”——24h 代谢物主要促进辛酸乙酯、癸酸乙酯生成，48h 代谢物主要促进乙酸异戊酯、异戊醇生成并降低挥发性脂肪酸，同时两组均不同程度影响部分酯类。
表1. 最终样品中基本参数和芳香化合物的浓度
02 - 酒精发酵过程中香气化合物的演变
为进一步明确 T. delbrueckii 代谢物对 S. cerevisiae 香气合成的影响，通过 HS-SPME-GC-MS 测定不同发酵时间点（24-168 h）香气物质的相对峰面积（RPA），分析其动态变化规律。
结果如图2所示，酯类物质中在发酵过程中呈现三种不同变化模式：
a.乙酸乙酯和乙酸异戊酯全程持续积累；
b.乙酸乙酯发酵前期骤升后波动，
c.辛酸乙酯呈现先升后降再升的趋势。
三类高级醇全程稳步上升，在发酵后期达到峰值；挥发性脂肪酸的动态变化呈现前期骤升后波动的规律，且三组的差异集中在 ST48 组。
这表明：T. delbrueckii 代谢物对 S. cerevisiae 香气合成的影响具有复杂性，且不同时序代谢物对香气物质动态积累的调控存在特异性。
图2. SC、ST24 和 ST48 处理下葡萄酒发酵过程中芳香化合物 RPA 值的动态变化
03 - 酿酒酵母的转录分析
为明确 T. delbrueckii 代谢物对 S. cerevisiae 转录组表达谱的影响，选取 ST24（48h/72h）、ST48（72h/96h）及 SC（48h/72h/96h）的 S. cerevisiae 菌体进行转录组学测序，以此解析糖代谢与香气合成相关基因的表达变化。
3.1 酿酒酵母中的差异表达基因
在 SC vs ST24 中，发酵 48h 仅有 7 个差异基因（DEGs），72h 有 40 个差异基因，且这些 DEGs 主要富集于糖酵解、碳代谢、氨基酸生物合成及次级代谢通路，表明 T. delbrueckii 24h 代谢物可激活 S. cerevisiae 的核心代谢通路；
在 SC vs ST48 中，发酵 72h 有 153 个 DEGs，发酵 96h 有 76 个 DEGs，其中下调基因主要集中在核糖体合成、氨基酸合成、糖酵解及碳代谢通路，这提示 T. delbrueckii 48h 代谢物对 S. cerevisiae 多数代谢通路有抑制作用（图3）。
图3. 酿酒酵母转录基因火山图谱和 KEGG 富集分析
3.2 香气合成与转录反应的关系
为探究 T. delbrueckii 代谢物调控 S. cerevisiae 香气合成的分子机制，分析葡萄糖代谢与香气相关基因的转录组特征，结果如图4所示。
（1）糖代谢基因表达变化：ST24 组发酵 72h，糖酵解关键基因 PGI1、FBA1、TDH1、PGK1 显著上调，加速糖酵解进程产生更多的香气前体，这和 ST24 组辛酸乙酯、癸酸乙酯升高一致。ST48 组中糖酵解核心基因 HXK4、PGI1、FBA1、TPI1、ENO1、CDC19 均显著下调，导致糖代谢速率降低，可能减少香气前体供应。
（2）酯类合成相关基因：ST24 组中，乙基酯合成的关键基因 EEB1 在 72h 时显著上调，这与 ST24 组辛酸乙酯、癸酸乙酯含量升高直接相关；ST48 组的 EEB1 及其他乙基酯合成基因（EHT1、MGL2）无显著表达差异。ST48 组中，乙酸异戊酯合成相关的 ATF1、ATF2、SLI1 均无显著差异。
（3）高级醇合成相关基因：ST24 组发酵 72h 时，BAP3、BAT1、PDC1 与 PDC5 显著上调，但 ST24 组高级醇含量与 SC 组无显著差异，这可能是因为这些基因参与其他生物功能，未完全转化为高级醇。ST48 组 BAP3、BAT1、ARO8/9/10、PDC1/5/6、ADH5 显著下调，但氨基酸转运关键基因 GAP1 上调，其可促进异戊醇前体氨基酸的摄入，这与 ST48 组异戊醇含量升高的结果一致，凸显 GAP1 在异戊醇合成中的核心作用。
（4）挥发性脂肪酸合成相关基因：ST24 组中，ACC1、FAS1、FAS2 的表达与 SC 组无显著差异，与 ST24 组挥发性脂肪酸含量无显著变化一致；ST48 组中，虽未直接检测到这些基因的显著下调，但结合其糖代谢基因下调导致乙酰 -CoA 减少的结果，推测 ST48 组挥发性脂肪酸含量降低与前体供应不足相关。
图4. ST24 和 ST48 处理下酿酒酵母中与糖酵解和芳香相关代谢途径相关的基因的相对表达
04 - 探索促进 S. cerevisiae 香气产生的关键代谢物
为探究提升 S. cerevisiae 香气合成的关键代谢物，采用非靶标代谢组学技术检测 T. delbrueckii（TD-24h）与 S. cerevisiae（SC-24h）纯发酵上清液。
结果显示在正负模式下分别检测到 4642 和 3698 个峰，其中鉴定出 869 种代谢物。正交偏最小二乘判别分析显示两组有明显的分离，且置换检验的模型参数为 R²Y=0.991、Q²=0.959（图 5A），这表明模型稳定可靠。根据 p<0.05 且 | Log2FC|>1 标准筛选得到两组间有 95 种显著差异代谢物（图5B），其中有 32 种高可信度差异代谢物（图5C)，其中 TD-24h 组含量显著高于 SC-24h 组的 7 种化合物被列为关键候选代谢物。
由于阿拉伯糖醇、β-亮氨酸、4-甲基氨基丁酸、柠康酸的代谢产物对香气调控作用未明确，因此通过外源添加实验进一步确定其调控机制。
将 4 种代谢物分别以低浓度（L：1mg/L）、高浓度（H：10mg/L）添加至 S. cerevisiae 纯发酵中，通过检测最终香气物质浓度，明确各代谢物的作用，结果如图6所示。
阿拉伯糖醇主要影响挥发性脂肪酸和酯类，呈现 “促酸抑酯” 特征；β-亮氨酸对香气的调控具有显著浓度依赖性，仅高浓度有效；无论 4-甲基氨基丁酸浓度高低均能促进关键香气物质合成；柠康酸与 4-甲基氨基丁酸功能相似，且能轻微降低不良风味物质。最终 β-亮氨酸、4-甲基氨基丁酸、柠康酸被确定为 T. delbrueckii 促进 S. cerevisiae 香气合成的核心代谢物，且高浓度 β-亮氨酸调控辛酸乙酯和癸酸乙酯，4-甲基氨基丁酸 / 柠康酸调控乙基己酸酯和乙酸异戊酯。
图5. TD-24h 和 SC-24h 组的代谢组学分析
图6. 外源添加代谢物的酿酒酵母纯培养物中，芳香族化合物的生成情况
研究小结
本研究通过细胞/培养基分离策略结合 HPLC、HS-SPME-GC-MS、转录组及非靶标代谢组分析，明确 T. delbrueckii 产生的代谢物可显著促进 S. cerevisiae 合成辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯及异戊醇等葡萄酒关键香气物质，且 T. delbrueckii 发酵 24h 的代谢物更易促进辛酸乙酯、癸酸乙酯生成，发酵 48h 的代谢物更易促进乙酸异戊酯、异戊醇生成；
转录组层面，T. delbrueckii 代谢物可上调 S. cerevisiae 中糖代谢基因及香气相关基因）的表达，为香气物质合成提供前体并激活关键酶促反应；非靶代谢组共鉴定出 869 种 T. delbrueckii 代谢物，其中 β-亮氨酸、4-甲基氨基丁酸与柠康酸为核心促香新型代谢物，该研究结果为酿酒过程中通过外源添加关键代谢物或优化酵母发酵时序定向调控葡萄酒香气特征提供了科学依据。
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