标题：Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices

发表期刊：nature methods

影响因子：28.3

研究背景

代谢组学虽然已发展多年，但与基因组学、转录组学和蛋白质组学相比，其数据覆盖度和标准化程度仍有巨大差距。代谢物在化学结构和丰度上的极端多样性，使得单一方法难以全面覆盖。此外，许多已发表的研究未能遵循既定的报告标准（如MSI标准），导致数据难以被他人复用或验证。而这些问题的关键还是缺乏清晰、简化的指南，因此需要一套简化、易于科研人员落地执行的实操指南，用以改善代谢组数据报告质量。由Saleh Alseekh和Alisdair R. Fernie等代谢组学领域的顶尖专家共同撰写的权威指南“Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices”发表于nature methods上。该指南涵盖样本制备、重复与随机化、定量、回收与重组实验、离子抑制以及峰误识别等方面，旨在解决当前代谢组学研究中数据质量参差不齐、难以复现和比较的痛点，为基于质谱的代谢组学实验设计、数据分析和报告规范提供了一套清晰、实用的最佳实践标准。

代谢组学工作流的关键环节

01.样本的采集、淬灭、提取与储存

样本的采集、淬灭、提取与储存是代谢组学工作流（图1和图2）中最关键的一步，其核心目标是获得一份能真实、定量地反映活细胞内源性代谢物水平的稳定提取物。其中，淬灭作为代谢组学实验的起点，需满足两个核心标准：

完全终止所有酶和化学反应的活性

避免扰动采样过程中已有的代谢物水平

对此，指南建议：对于普通组织样本，应快速取材后液氮速冻，置于80 ℃条件下低温保存，直至开展提取实验；而大块组织应优先采用冷冻钳夹法(Wollenberger clamp)，否则液氮浸泡时组织中心冷却过慢，淬灭不彻底。此外，样本处理中的常见陷阱也需格外警惕：

（1）不正确的冻干操作。因操作不当、未密封产生的色素人工异构体伪信号；挥发性代谢物的检测需新鲜样本，禁止冻干。

（2）避免不当的储存。样本切勿040 ℃区间储藏；干燥样本应当尽量缩短储存周期，尽快上机检测。

（3）解冻过程的风险。样本解冻仍可能重新激活降解酶，干扰后续注释与定量，富含次生代谢物的提取液应格外注意。

（4）培养基与溶剂处理。该流程存在两类不可忽视的风险：

洗涤操作造成部分代谢物损失

溶剂去除引发样本浓缩，加快代谢物间化学反应速率。因此前处理方法需要针对性优化

指南还着重提出：采用新技术或研究新组织、新物种时，应当开展回收率与提取物重组实验完成方法学验证；质谱仪器精度再高，也无法校正样本前处理引入的系统性误差，样本阶段的质控是代谢组实验不可或缺的部分。

图1. 代谢组学工作流程

02.样本重复与随机化

代谢组学的可靠性不仅取决于分析化学，更取决于实验设计的严谨性。重复和随机化不是“可选项”，而是“必选项”，指南强调：

（1）合理设置重复，包括“分析重复、技术重复、生物学重复”三类。其中，生物学重复优先级最高，建议至少4个，样本获取条件需严格统一。另外，新体系的开展需预实验评估变异水平，以确定合理样本量。

（2）样本上机顺序必须进行时空随机化。非随机的检测顺序会受样本存放时间、仪器性能漂移干扰，既可能掩盖真实组间生物学差异，还会引入假阳性，在大规模代谢自然变异研究中风险更高。

（3）质控样本与批次校正为实验必备要素。可选用定值标准品混合液，或是大批量标准化生物提取物作为参考样本，改善定量准确度，适配公共代谢数据库。需要注意：PoolQC混合质控样本仅能校正研究内部进样顺序及批次效应，跨实验比对必须使用标准参考物质。

03.定量分析

前述的提取、保存和重复的原则，同样可用于保障各类定量方法的准确性（图2）。非靶标代谢组学尤其需要确保：

所有具有潜在研究价值的代谢物须能在检测线性范围内被测量

以完整组织起始的实验必须确保组织被完全破碎

细胞研究应当明确是否同时检测胞外代谢组

定量方面，相对定量是LC-MS和GC-MS中的主流方式，但不同代谢物电离效率存在差异，所以峰强度不能直接代表绝对浓度。绝对定量常见于核磁共振(NMR)中，可实现不同化合物峰强度的相互比较，但其依赖标准曲线和纯标准品，很难实现大规模代谢物全部建标。对于外标法，由于标准品校准体系基质远比生物提取液简单，所以其定量问题尤为突出，因此指南推荐同位素标记内标定量或是内标外标联合定量方案。

无论采用绝对定量还是相对定量，“以什么为基准表达数值（定量基准）”才是数据可比性的根本前提，例如组织样品通常以每克鲜重或干重表示，体液以每单位体积表示，细胞样品则以每毫克蛋白质或细胞计数表示，而这些常被研究者们所忽视，严重影响数据的生物学解释。

图2. 基于质谱的典型代谢组学工作流程

04.回收率与提取物重组实验

回收率实验早在上世纪就被提出，但受限于标准品可得性，在代谢组领域并未普及，且完全无法应用于未知代谢物。对此，指南建议引入提取物重组实验(Extract recombination)作为替代方案，其设计思路为：将待测的样本提取物与经过充分表征的参考提取物（大肠杆菌、拟南芥、人源体液等）混合，既可通过分析混合后的信号变化来评估提取体系的可靠性，还能评估离子抑制引发的基质效应，检验已知代谢峰定量结果是否可靠。回收与重组实验示意图见图3。当该方案执行时，回收率的判定应遵守如下原则：

回收率70%130%为普遍可接受范围；

若回收率偏离区间，但结果稳定、线性关系良好，数据仍可使用，但必须在文章中明确标注，提示读者谨慎解读；

回收率差不代表数据必须舍弃，但不能隐匿质控结果。

另外，指南强调，部分已有文献因缺失该类质控，出现生物学上完全矛盾的结果。因此，对于已知代谢物，应在每种新组织类型或新物种的研究中均开展回收实验或重组实验。

图3. 回收率实验

05.离子抑制 

离子抑制是LC-MS分析中的普遍问题，主要由基质效应引起，会干扰共流出分析物的电离，影响定量精密度和准确度，甚至使低丰度代谢物无法被检测到。所以，当某个分析物的离子强度下降时，或许并不是其真实含量降低，有可能是共流出物质带来的离子抑制假象。这就意味着，信号降低≠浓度降低。目前，评估离子抑制影响的最佳方法，正是前文讨论的提取物重组实验（见第4节）。该法不依赖纯标准品，因此特别适合未知分析物或标准品难以获得的体系。另外，尽管当前不存在可以完全消除离子抑制的万能方案，但仍可通过改进样品前处理、提高色谱选择性、选择合适的离子源和极性等策略减轻其影响，增加结果可靠性。最后，指南特别强调，方法验证中必须考虑离子抑制，并在解释结果时保持谨慎；即使无法完全消除，也应报告评估结果，让读者判断数据可靠性。

06.峰的错误鉴定

色谱与质谱、串联质谱的正交使用，辅之以生物信息学工具，为分析物鉴定提供了极高的特异性和准确性。然而，即便如此完善的技术框架下，峰的错误鉴定却仍难以规避，主要原因如下：

（1）同分异构体干扰：分子式相同，结构与生物学功能迥异，仅高分辨质谱不足以完成区分，如葡萄糖果糖、柠檬酸异柠檬酸均属于该类。指南建议，可采用HILIC、离子对色谱、衍生化提升分离。若无法分离，文章必须明确标注，不可直接合并报道。

（2）质谱色谱双重峰重叠：部分离子质量差异小于5 ppm，仪器分辨率不足以分辨；如果色谱同样不能将其分开，就会产生错误注释。

（3）LC-MS特有：源内降解。ESI电离阶段发生脱水、脱磷酸、分子重排，产生假碎片，混淆共流出物质的解析，同时削弱母离子信号。

上述这些情况要求对峰归属进行细致人工校验；但面对成百上千代谢物注释时，全部人工校正往往难以实现（图4）。因此，遇到鉴定存疑的峰，可借助比较生化手段佐证，例如：

分析目标代谢物缺失的突变体代谢组；

纯化峰进行酶/化学处理；

结合标准品比对；

双标记技术完成异构体注释。

最后，指南补充道，非靶标代谢组必须重视峰过滤；数据集含有大量无效特征，会干扰后续统计分析，需要灵活、自适应的数据过滤策略。

图4. 代谢组数据处理及后续结果归档记录工作流程

07.报告透明度

代谢组学数据的价值不仅取决于单次实验的质量，更取决于它能否被其他实验室独立验证和有效复用——而这一目标的实现，完全依赖于方法报告的充分性与标准化程度。对此，论文需要提供详尽的方法信息，指南提出“双胞胎测试”自检原则：如果你不确定该提供多少方法细节，就想象你的双胞胎坐在另一个大陆，面前有类似的仪器，必须根据你的描述把设备配置成可比的状态——如果你的方法部分无法让他/她做到这一点，那么报告的详尽程度就不够。同时，指南还建议研究者多使用软件和标准格式从原始数据文件中提取方法信息（图4c），例如转换为mzML格式后自动提取方法学元数据，用以降低报告完备性的操作门槛，使详尽的方法学描述不再完全依赖作者的手工撰写。

另外，受限于期刊字数限制和论文简洁性要求，研究者往往不在正文中详细说明注释的确切性质，但补充材料或线上公开资源则完全可以承载这些信息。MetaboLights、Metabolomics Workbench等数据库已经被很多期刊列为数据提交要求。最后，指南推荐一种精简、简化的报告方法（图5），并提供了两个补充表格(SupplementaryTable1/Table2)作为Microsoft Excel模板，而这些的学习仅需3060分钟就可以完成元数据整理。相比之下，对于包含数百到数千个样本的大型数据集，上传到代谢组学公共数据库所需时间要长得多。

图5. 代谢物注释与信息归档

研究总结

这篇指南旨在希望为基于质谱的代谢组学研究建立一套标准化的实践方法，以应对代谢物化学结构多样、丰度动态范围宽等带来的分析挑战，从而提升数据的质量、可靠性与跨实验室可比性。文章系统性地梳理了从样品制备、淬灭、提取到色谱-质谱分析的全流程，并针对离子抑制、峰误鉴定（如同分异构体、源内降解）等核心难题，提出了包括提取物重组实验在内的具体评估与缓解策略。最后，指南强调了报告透明度的重要性，提出了“双胞胎测试”原则，并推荐了一套简化的报告模板，鼓励研究者在补充材料或公共数据库中详尽记录方法学信息，以促进数据的复用与科学发现的可验证性。